우리는 교실 및 연구 응용 분야에 적합한 C.elegans 게놈 DNA를 추출하는 쉽고 빠르며 비용 효율적인 방법을 개발했습니다. 이러한 프로토콜은 PCR 기반 애플리케이션을 위한 C.elegance의 단일 또는 작은 샘플로부터 DNA 템플릿을 신속하게 생성하는 데 안정적으로 사용될 수 있습니다. 웜을 따거나 마이크로 피퍼터를 사용한 경험이 없는 사용자는 이러한 기술이 필요한 단계에 어려움을 겪을 수 있습니다.
숙련 된 개업의를보고 연습하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 수석 대학원생 인 Farhan Lakdawala가 될 것입니다. 단일 예쁜꼬마선충 웜으로부터 DNA를 추출하기 위해, 먼저, 섭씨 55도에서 10분 동안 한 사이클씩 구성한 후 열순환기에서 섭씨 95도로 구성된 용해 프로그램을 설정한다.
용해 용액을 준비하려면 먼저 키트에서 0.8 마이크로 리터의 추출 용액을 얼음 위의 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 내부 벽에 첨가하십시오. 그런 다음 키트에서 0.2 마이크로 리터의 조직 준비 용액을 추출 용액의 액적에 넣고 페팅하여 혼합하십시오. DNA 추출을위한 웜을 선택하면 먼저 해부 현미경으로 L4 또는 성인 동물을 확인하십시오.
L4 hermaphrodite는 동물의 중간에 창백한 반원으로 보이는 특징적인 외음부로 식별 할 수 있습니다. 성인 hermaphrodite를 확인하려면, 자궁에 타원형 배아가 보일 수있는 판에서 가장 큰 동물 중 하나를 선택하십시오. 다음으로, 백금 와이어 픽을 사용하여 선택된 동물을 용액으로 옮깁니다.
튜브의 바닥에서 내용물을 수집하려면, 실온에서 2000 x g에서 2 내지 세 초 동안 튜브를 원심분리한다. 그런 다음 튜브를 열 순환기에 놓고 이전에 설정된 용해 프로그램을 실행하십시오. 이 용해 프로그램이 끝나면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다.
그런 다음 키트에서 0.8 마이크로 리터의 중화 용액을 넣고 피펫팅으로 혼합하십시오. 다시, 튜브를 실온에서 2000 x g에서 2 내지 세 초 동안 원심분리한다. 용해물을 즉시 사용하지 않으면 나중에 사용할 수 있도록 튜브를 섭씨 네 도에 보관하십시오.
또한 개별 웜으로부터 DNA를 추출하려면 먼저 섭씨 55도에서 10분 동안 한 사이클의 용해 프로그램을 설정한 다음 섭씨 95도에서 3분 동안 열순환기로 설정합니다. 다음으로 먼저 키트로부터 추출 용액 2 마이크로리터를 얼음 위의 0.2 밀리리터 PCR 튜브의 내벽에 첨가한 다음, 키트로부터 0.5 마이크로리터의 조직 준비 용액을 추출 용액의 액적에 첨가한 다음, 피펫팅하여 내용물을 혼합함으로써 용해 용액을 준비한다. L4 또는 성인 동물을 확인한 후 플래티넘 와이어 픽을 사용하여 적절한 수의 동물을 용액으로 옮깁니다.
다음으로, 실온에서 2000 x g에서 2 내지 세 초 동안 튜브를 원심분리한 다음, 튜브를 열순환기에 넣고 이전에 설정된 용해 프로그램을 실행한다. 프로그램이 끝나면 튜브를 간단히 원심 분리하여 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 키트에서 튜브에 중화 용액 두 마이크로 리터를 넣고 피펫팅으로 혼합하십시오.
다시, 튜브를 실온에서 2000 x g에서 2 내지 세 초 동안 원심분리한다. 즉시 사용하지 않을 경우, 나중에 사용할 수 있도록 용해물을 섭씨 네 도에 보관하십시오. 프로토콜에 의해 추출된 게놈 DNA는 PCR 주형으로 성공적으로 사용될 수 있었고, 상용 키트와 전통적인 프로테이나제 K 방법 모두 2100 염기쌍 생성물과 500 염기쌍 생성물의 유사한 수준의 PCR 증폭을 갖는 DNA를 생산하였다.
DNA 용해를 위한 키트 방법은 또한 다양한 DNA 중합효소 효소에 효과적인 PCR 주형을 제공하였다. 상이한 희석에서도, 상용 키트에 의해 단일 동물로부터 추출된 DNA는 동등한 효율로 2100 염기쌍 DNA 단편의 PCR 증폭을 지원하였다. 그러나, 500개의 염기쌍 DNA 단편의 증폭은 주형 농도에 따라 다양하였다.
유전자형을 결정하기 위한 PCR 주형으로서 단일 동물 또는 다수의 동물로부터 추출된 DNA의 적합성은 유전자 및 이의 돌연변이된 변이체의 성공적인 증폭에 의해 추가로 입증되었다. 이 프로토콜은 소량의 시약을 피펫팅하는 것을 포함하므로 일관성을 보장하기 위해 여러 반응, 우수한 배관 기술 및 잘 보정 된 피펫에 마스터 믹스를 사용하십시오. 또한 튜브의 내용물을 회전하면 적절한 용해가 보장됩니다.
이 방법은 다른 하류 적용을 위해 C.elegans 게놈 DNA를 추출하도록 조정되고 확장 될 수 있으며 다른 선충류 종에서 DNA를 추출하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 단순성, 속도, 견고성 및 저렴한 비용을 감안할 때 시간과 자원이 제한된 연구 및 교실 응용 프로그램 모두에 매우 적합합니다.
