Desenvolvemos um método fácil, rápido e econômico de extrair DNA genômico de C.elegans que funciona muito bem para aplicações em sala de aula e pesquisa. Esses protocolos podem ser usados de forma confiável para produzir rapidamente modelos de DNA a partir de uma única ou uma pequena amostra de elegância c.para aplicações baseadas em PCR. Usuários que não têm experiência em escolher worms ou usar um micropipetter podem ter dificuldades com etapas que requerem essas habilidades.
Observar um praticante qualificado e praticar pode ajudar. Demonstrando o procedimento estará Farhan Lakdawala, um estudante de pós-graduação sênior do meu laboratório. Para extrair DNA de um único verme de Caenorhabditis elegans, primeiro, defina o programa de lise consistindo de um ciclo a 55 graus Celsius por 10 minutos seguido de 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador.
Para preparar a solução de lise, primeiro, adicione 0,8 microliters de solução de extração do kit à parede interna de um tubo PCR de 0,2 mililitro no gelo. Em seguida, adicione 0,2 microliters de solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração e misture por acariciar. Com a seleção de um verme para extração de DNA, primeiro, identifique um L4 ou um animal adulto sob um microscópio dissecando.
Uma hermafrodita L4 pode ser identificada por uma vulva característica que é visível como um meio círculo pálido no meio do animal. Para identificar uma hermafrodita adulta, selecione um dos maiores animais na placa que pode ter embriões ovais visíveis em seu útero. Em seguida, usando uma picareta de fio de platina, transfira o animal selecionado para a solução.
Para coletar o conteúdo na parte inferior do tubo, centrifugar o tubo por dois a três segundos a 2000 x g em temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise definido mais cedo. Depois que este programa de lise acabar, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo.
Em seguida, adicione 0,8 microliters de solução de neutralização do kit e misture por pipetação. Novamente, centrifufique o tubo por dois a três segundos a 2000 x g à temperatura ambiente. Se o liseto não for usado imediatamente, armazene o tubo a quatro graus Celsius para uso futuro.
Extrair DNA de um verme individual também, primeiro, defina o programa de lise de um ciclo a 55 graus Celsius por 10 minutos seguido de 95 graus Celsius por três minutos em um termociclador. Em seguida, prepare a solução de lise adicionando primeiro dois microliters da solução de extração do kit para a parede interna de um tubo PCR de 0,2 mililitro no gelo, seguido pela adição de 0,5 microliters da solução de preparação tecidual do kit à gota da solução de extração, em seguida, misture o conteúdo por pipetação. Depois de identificar L4 ou animais adultos, use uma picareta de fio de platina para transferir um número adequado de animais para a solução.
Em seguida, centrifugar o tubo por dois a três segundos a 2000 x g em temperatura ambiente, em seguida, coloque o tubo no termociclador e execute o programa de lise previamente definido. Após a conclusão do programa, centrifufique brevemente o tubo e coloque-o no gelo. Em seguida, adicione dois microliters da solução de neutralização do kit ao tubo e misturado por pipetação.
Novamente, centrifufique o tubo por dois a três segundos a 2000 x g à temperatura ambiente. Se não for usado imediatamente, armazene o lysate a quatro graus Celsius para uso futuro. O DNA genômico extraído pelo protocolo poderia ser usado com sucesso como modelo PCR, tanto o kit comercial quanto o método tradicional proteinase K produziram DNA com níveis semelhantes de amplificação PCR de um produto de par base de 2100 e um produto de par de base de 500.
O método do kit para lise de DNA também forneceu modelos pcr eficazes para uma variedade de enzimas de polimerase de DNA. Mesmo em diferentes diluições, o DNA extraído de um único animal pelo kit comercial apoiou a amplificação pcr de um fragmento de DNA de par de base de 2100 com eficiência equivalente. No entanto, a amplificação de um fragmento de DNA de par de 500 bases variou com a concentração do modelo.
A adequação do DNA extraído de um único animal ou de vários animais como modelo pcr para determinar o genótipo foi ainda demonstrado pela amplificação bem sucedida de um gene e sua variante mutada. Como este protocolo envolve a pipetação de pequeno volume de reagentes, para garantir a consistência, use uma mistura mestre para múltiplas reações, boa técnica de tubulação e pipetas bem calibradas. Além disso, girar o conteúdo do tubo garante a lise adequada.
Este método poderia ser ampliado, adaptado para extrair DNA genômico de C.elegans para outras aplicações a jusante, e poderia ser usado para extrair DNA de outras espécies de nematoides. Dada a simplicidade, velocidade, robustez e baixo custo do protocolo, ele é adequado tanto para pesquisas quanto para aplicações em sala de aula, onde o tempo e os recursos são limitados.
