我々のプロトコルは、実験的な新生児敗血症モデルにおける細菌の播種および負担追跡をリアルタイムで可能にし、疾患の他のマーカーを病原体の負担と相関させる能力を可能にする。このプロトコルは、個々の新生児マウスの敗血症を縦断的に分析することを可能にし、感染ダイナミクスと細菌播体をリアルタイムで観察し、比較する機会を提供する。新生児敗血症の介入の前臨床検査は、細菌の宿主制御の効果の監視を可能にする、この方法で行うことができる。
まず、年齢に一致した子犬をバイオセーフティレベル2キャビネット内の高用量または低用量ごみグループに配置します。出生後3日または4日目に、接種前にすべての子犬の体重を記録する。バイオセーフティキャビネットにPBSまたは高用量または低用量の大腸菌lux inoculumでインスリン注射器をロードし、氷の上にロードされた注射器を置きます。
バイオセーフティキャビネット内の清潔な表面に注射される新生児を置き、子犬をこするかのように首のうなじで皮膚を上げます。皮膚と筋肉の間に作成された空間の皮膚のすぐ下に針のベベルを挿入します。針が皮膚の下に感じられる場合は、50マイクロリットルの接種剤を注入し、同時に皮膚のつままれた部分を放出して逆流を防ぎ、針をゆっくりと注意して取り除きます。
すべての子犬が同じ方法で注入されたら、子犬をダムに戻します。注射直後に、そしてその後の適切な実験時点で、大腸菌lux感染新生児マウスとダムを用いたケージをバイオセーフティレベル2層流フードに入れ、マイクロCTコンピュータでソフトウェアを開きます。システムを初期化し、ステージ温度が摂氏37度でロックし、CCD温度がマイナス90°Cでロックされるのを待った後、最大4匹の麻酔付き子犬を撮影室のイメージングボックスに置きます。
イメージングチャンバのドアを閉め、発光イメージングオプションを選択します。開いたフィルタを選択し、次に、ブロックする励起フィルタと開くエミッションフィルタを設定します。500、520、560、580、600、および620ナノメートルを選択します。
その後、麻酔回復まで監視してダムに戻す前に、子犬を画像化します。適切な実験エンドポイントで、バイオセーフティキャビネットで、70%エタノールで安楽死させた新生児を使用して汚染を防ぎ、動物を右側に置きます。鉗子を使用して腹部と後部左足の間の皮膚をつかみ、細かい先端の外科用はさみを使用して皮膚切開を行います。
その後、脾臓全体が露出するまで動物の背中に向かって切開を続ける。鉗子とはさみを使用して腹部から脾臓を取り除き、下流の塗布に適した溶液に入れる。肺を得るために、胸部の皮膚を完全に剥がし、胸骨の基部に垂直に保持されたはさみで入り込み、リブケージが分割されるまで上向きに切断する。
鉗子を使用して右肺と左肺を個別に把握し、胸腔から肺を取り除く。はさみで肺組織から心臓を取り除きます。次に、下流のアプリケーションに適した溶液に肺を配置します。
インビトロ細菌殺死アッセイを行うために、感染していない脾臓を40マイクロメートルのナイロンストレーナーに入れ、10%胎児ウシ血清を補った5ミリリットルのPBSを含む無菌60ミリメートルのペトリ皿に入れ、無菌3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して組織を単一細胞懸濁液に分解します。細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移し、遠心分離によって回収する。3~4個の脾臓あたり1ミリリットルの赤血球ライシスバッファーでペレットを再懸濁します。
室温で5分後、PBSで脾臓を洗浄し、250マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁し、ウシ血清アルブミンと2ミリモルEDTAを加えてカウントする。次に、メーカーのプロトコルに従って適切な免疫磁気ビーズでLy6 B2陽性細胞を分離し、濃縮されたLy6 B2陽性細胞を10倍の5細胞に、黒または白の96ウェルプレートの完全な培地あたり5個の細胞に1回播種します。細菌接種を1ウェルあたり100マイクロリットルの最終体積で所望の感染多重度で調製し、各ウェルに100マイクロリットルの細菌接種または培地を加えて、細胞培養インキュベーターで1時間のインキュベーションを行う。
インキュベーションの終わりに、培地を200マイクロリットルの新鮮な完全な培地に交換し、ジェンタマイシンの1ミリリットル当たり100マイクログラムを添加して、残りの細胞外細菌を除去し、細胞を細胞培養インキュベーターにさらに2時間戻します。インキュベーションの終わりおよび以降の各実験時点で、プレートリーダーを用いて、次の読み取りまでプレートを細胞培養インキュベーターに戻す前に、蓋付き培養プレートの各ウェルにおける発光を測定する。ほとんどの動物は感染後24時間で血液中に高レベルの細菌を示すが、一部の子犬は血液中の細菌が低いか検出不可能であり、この時点までに感染のクリアランスを示唆している。
さらに、生物発光大腸菌に感染した新生児Ly6 B2陽性脾臓細胞は、細胞外細菌の除去とその後のゲンタマイシン治療の前に1時間にわたり、細菌クリアランスを示す時間の経過とともに減少する高レベルの発光を発現した。発光細菌の生きた動物イメージングは、感染後10時間および24時間の経時に新生児の子犬における細菌の播種および増殖の増加をさらに確認する。マイクロCTと組み合わせた生体内イメージングは、脳内の感染病巣の同定を容易にします, 肺, および他の末梢組織.
いくつかの感染性の高いマウスの肺は、細菌の発光シグナルに共局化する炎症性の統合と一致する不透明な領域を示す。これらの推定炎症性滲出物の領域は、未感染制御肺では認められない。コントロールに対する炎症性サイトカイン発現の有意な増加は、低および高の接種群の両方においても観察され、肺胞壁の顕著な肥厚と相関し、肺胞出血の増加、およびこれらの動物における炎症性浸潤と観察される。
覚えておくべき最も重要なことは、注射を行うときに適切な技術を実行し、麻酔を投与する際に新生児に厳しい注意を払うことである。この技術を用いて、新生児敗血症をリアルタイムで可視化し、免疫応答の改善を目的とした介入を研究し、指向療法をホストすることができます。
