ニプン・バスル、アドリアナ・K・ロサス・ヴィルガス、ナダフ・シャイ、トレバー・ソレルズの原稿に関するコメント、中陰ゴングとカイロロス・バルソウムの技術支援に感謝します。 図1で使用されている写真を撮ってくれたアレックス・ワイルドに感謝します。K.V.はベーリンガー・インゲルハイム・フォンズ博士フェローシップによって支えられていました。V.J.はNIH T32-MH095246の一部でサポートされました。この研究の一環として、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ・プログラムを通じてロックフェラー大学への助成金がV.J.に支えられた。この資料は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムの助成No.の支援を受けた作業に基づいています。NSF DGE-1325261 から V.J.この資料に記載されている意見、調査結果、結論または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映しているわけではありません。

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著者らは開示するものは何もない。

多くの実験室の適用のために、人工膜フィーダーは研究者が直接食事の内容を操作する機能を可能にすることによって生きているホストと比較して明確な利点を提供する。人工膜送出には複数の方法が用意されていますが、ここで説明する方法は柔軟性、コスト、スループットの利点があります。他の市販の膜フィーダーと比較して、Glytubeアッセイは、必要な総容積を7、35に抑えることによって、薬物または病原体を含む高価な試薬のための効率的な送達メカニズムを作る、少量の食事量を必要とする。タンパク質フリーの生理食糸と人工血液の食事の両方がエングレーギンメントを促進するので、化合物または病原体は、注射に対するハイスループットおよび非侵襲的な代替手段として、食事に加えることができる。さらに、Glytubeの各成分は、容易に洗浄、交換、またはスケールアップすることができ、給餌装置の交差汚染なしに複数の食事タイプを提供および定量化することができます。
蚊が消費する食事量を定量化するために、蛍光ベースの方法は、摂食の前後に蚊の重量を量るよりも、より正確な食事サイズの定量を可能にする。なお、この方法は終点アッセイである。対照的に、計量は蚊がさらなる実験のために生き続けることを可能にする。プレートリーダーを使用することにより、蛍光ベースの方法を簡単にスケールアップして、何百人もの女性が消費する食事のハイスループット定量化を行うことができます。
高い給餌率を達成するには、女性のホストシーク行動を活性化し、フィーダーに女性を引き付けるのに十分なホストキューが存在する必要があります。蚊がグリチューブの下に混雑していない場合、食事が適切に温められていないか、CO2 の配達が十分でない可能性があります。膜表面に人臭を加えると、人工膜の魅力が確実に高まります。グリチューブの下で蚊が観察されるが、餌を与えることができない場合、食事の組成に欠陥がある可能性があります。女性は、食事自体が暖かくなければ、血液が古すぎる、または食事への添加物が本質的に回避的であるか、または望ましくない化学反応36を引き起こす場合、餌を与えないかもしれない。追加のATPも確実に供給速度を増加させ、提供される各レシピの2 mMの最終濃度にスケールアップすることができる。パラフィルムがGlytubeキャップを横切って引っ張られていない場合、女性は餌を与えることができません。これは女性が効果的に彼女のスタイでパラフィルムを突き刺すことができるのを防ぐので、パラフィルムは均一に透明であるべきであり、バックルすべきではありません。食事がGlytubeを通ってメッシュに漏れた場合、パラフィルムはストレッチプロセス中に破れた可能性があり、交換する必要があります。
食事の組成を変更すると、研究者は、中間腸から食事をクリアするために必要な時間の長さと、その後のホストシーク行動を操作することもできます。ここで提示される食事は、動物由来の血液と同様の消化7 のために24〜36時間を必要とします。これらの食事のいずれかを食べ物を与えた後、女性は消化時間のウィンドウ中に宿主を求めることを抑制します。生理食前の食事にはタンパク質が欠けているため、女性は食事が取り除いた後に宿主を求めて戻ります。より速いリターンが望ましい場合、研究者は約6時間27で排泄される代替の「迅速なクリア」生理食音の食事を選択することができます。ここで提示される生理食塩水の組成は、人工血液食事と直接結果を比較するために一致しているが、"迅速なクリア"食事は、脊椎動物の血液中に見られる生理学的塩分濃度とより密接に一致する。
ここで説明する方法には、研究者の実験目標に最も適したアッセイを選択する前に考慮すべき制限があります。記載されたフルオレセイン測定では、蚊を追加の実験に再び使用することはできません。しかし、体重の測定は、フルオレセインアッセイを用いて食事サイズ定量の前に行うことができる。体重と食事のサイズが特定の食事の複数の試験で一貫している場合、体重は将来の実験で代理として使用することができます。さらに、このプロトコルは、ホストシークと血液供給行動の欠損を区別しません。膜フィーダーを見つけることに障害を示す蚊は、摂食率および/または食事のサイズの減少を持つことになります。アッセイ全体の行動を記録するためにカメラを追加することで、研究者は女性がGlytubeを見つけることができないかどうか、またはGlytubeを見つけるが餌を与えないかどうかを判断することができます。
ここで説明するアッセイは、蚊の摂食行動に関連する多くの顕著な質問を探求するために適応することができる。例えば、特定の血液タンパク質の寄与は、人工血液の食事中の構成タンパク質または総タンパク質濃度の比率を変化させることによって探索することができる。複数の摂食イベントから食事のサイズを評価するために、独特の蛍光スペクトルを有する色素を添加して、食事を独特の供給源37と区別することができる。このプロトコルはまた、血液を検出し、摂取に使用される内部マウスパーツ(すなわち、stylet)と、蚊が血液供給を開始するために着陸する蚊として接触する化学感覚の付属物(すなわち、陰唇、脚)を個別に刺激するように変更することができる。例えば、リガンドを食事に直接加えた場合、膜はスタイレットによってのみ穿孔されるため、陰素と脚に接触しません。代わりにパラフィルムの外表面にリガンドを添加した場合、それらは食事から分離されたままであり、陰唇と脚36によって接触され得る。最後に、血液供給行動の詳細な運動学はよく理解されておらず、ここで提示される方法は、高解像追跡と機械学習ツールを組み合わせて、移動、姿勢、および摂食ダイナミクス38の行動読み出しを抽出するように変更することができる。
このプロトコルは、蚊の採血と摂食後の行動を研究するために薬理学的および遺伝子操作を採用する研究者にサービスを提供する能力を持つ、ユーザーフレンドリーで費用対効果の高いことを目的としています。

人工膜フィーダーを使用して Aedes aegypti 蚊に修飾された血液食事を供給し、個々の蚊が消費する食事量を正確に測定するためのプロトコルを提示します。このプロトコルは、食事の内容を変更したり、蚊の異なる実験群によって消費される食事量を比較するために柔軟に適応することができる。
Ae. aegypti蚊は、黄熱病、デング熱、チクングニア、ジカ1、2、3、4、5などの病気を引き起こす病原体を広めることによって、世界の健康を脅かす。Ae. aegyptiメスは血液供給者を義務付ける。卵の発達に必要なタンパク質を得るために脊椎動物の血液を消費する必要があり、卵の各クラッチは少なくとも1つの宿主6、7、8からの完全な血液の食事を必要とします。メスの蚊は、まず彼女のスタイレットで皮膚を突き刺し、宿主の免疫応答を引き起こす化合物を含む唾液を注入することによって、彼女のホストを噛む9.その後、彼女は彼女のステーレットを通して彼女の中間に血液を送り込んで餌を与えます。感染した宿主から血液の食事を摂取しながら、彼女は血液媒介病原体6、8を摂取し、蚊の中腸から唾液腺10に移動する。この方法で感染した雌の蚊は、その後の宿主11、12を噛むときに唾液と一緒に病原体を注入することによって病気を広めることができる。血液供給行動のメカニズムを理解し、定量化することは、蚊媒介性疾患の伝染を制御する上で重要なステップです。
蚊の飼育と実験のための多くの実験室プロトコルは、マウス、モルモット、またはヒトを含む生きた動物を血液源13、14、15、16として使用する。生きた動物の使用は倫理的な懸念と、人員訓練、動物の住宅とケア、および制度的動物ケア・使用委員会(IACUC)政策の遵守に対する複雑な要件を課しています。また、蚊に送ることができる化合物の種類を制限します,これは、実行することができる研究を制約します 17 .
人工血液供給装置は、通常、宿主の皮膚をシミュレートするために膜システムを使用し、ライブホストの維持の必要性を回避する血液供給行動を研究するための有用なツールである。全血は、ベンダーの数から購入し、加熱された水ジャケット人工膜フィーダーまたは同様のデバイス18、19を使用して蚊に供給することができます。このプロトコルでは、「Glytubes」と呼ばれている小型の使い捨て膜フィーダーの使用を実証する。コスタ・ダ・シルバら(2013)20によって以前に発表されたこの膜フィーダーは、標準的な実験室機器から簡単に組み立てることができ、血液食事を適度な数の蚊に送り込むのに理想的であり、より大きなグループまたは複数の食事製剤をテストするためにスケールアップするのが簡単です。Glytubeは、他の商用人工フィーダーに代わる安価で効率的な代替物であり、食事量が大きい場合があり、単一の食事製剤21上で蚊の大きなグループをバッチ供給するのに適している。
このプロトコルには、人工食事の準備/配達と消費の定量化の2つのセクションが含まれています。最初のセクションでは、Glytubesは、操作された食事を提供するための効率的な手段として使用されています。全血は、血液の代わりに血液置換の効果を比較するために、完全に人工的な食事で置き換えることができます。コーガン(1990)22から適応したレシピがここで提示されていますが、複数の人工食事製剤が23,24に開発されています。さらに、給餌は、注射よりも薬理学的化合物を導入するための侵襲性が低く、手間のかからない方法です。各食事に必要な総容積(1~2 mL)が少ないため、このプロトコルは高価な試薬の量を減らすための魅力的な送達方法を提供します。ae. aegyptiメスは、単一の食事成分の効果を測定するためのベースラインを提供するアデノシン5′三リン酸(ATP)25、26と生理食塩水のタンパク質フリーの食事を容易に消費します。例えば、Ae.aegyptiにおけるニューロペプチドY様受容体7(NPYLR7)は、タンパク質が豊富な血液食事の後に宿主を求める抑制を仲介することが知られており、NPYLR7アゴニストがタンパク質を含まない生理食前の食事に添加されると、雌蚊は全血を消費したものと同様の宿主求めの抑制を示す。
第2のセクションでは、個々のメスの蚊が消費する各食事の量を定量化するためのステップが提示される。このアッセイは蛍光ベースで、腹部の膨満度の視覚的評価に基づいて女性が「供給」または「未供給」に分類される方法よりも高い解像度で摂食状態を捉える。摂食前に食事にフッ素を加えることで、個人が摂取した食事量を96ウェルプレートで均質化し、蛍光強度を読み出しとして測定することで定量化することができます。このアッセイは、食事組成や蚊の遺伝的背景などの変数に応答して、供給活力の違いを測定することができます。正確な定量化は、中間食事のサイズ、例えば女性が摂食抑止力を含む最適でない食事を提供される場合、または可変サイズ27のスクロースミールを消費する場合に重要である。食事サイズの定量化後のその後の行動アッセイに蚊を与える必要がある場合、食事のサイズは、代わりに麻酔薬をグループで計量し、個人あたりの平均増加質量を推定することによって計算することができます。フルオレセインマーキングよりも精度は低いが、計量は依然として食事量の集計推定値を提供し、食事が下流プロセス(例えば、胎児性または後の宿主誘引力)に及ぼす影響を調べることができる。血液の食事のサイズは可変であり、無数の因子11、28、29の影響を受けることができるが、ここで説明する方法で測定された摂取された食事サイズは、以前の定量7、30、31と一致している。

<table><tbody><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>3 mm diameter borosilicate solid-glass bead</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z143928</td><td>For use for bead mill homogenizer; not required if using pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>32 oz. high-density polyethylene (HDPE) plastic cup</td><td>VWR</td><td>89009-668</td><td>Example mosquito container used for feeding assays shown; alternate options can be used</td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>96-well black polystyrene plate</td><td>ThermoFisher</td><td>12-566-09</td><td></td></tr><tr><td>96-well PCR plate sealing film</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>96-well PCR plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9621</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate</td><td>MilliporeSigma</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Albumin (human serum)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A9511</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213</td><td>Alternate options can be used to block light entering fluorescein container</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-911</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Bead mill homogenizer</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td>Not required if using pellet pestle grinder</td></tr><tr><td>Cotton ball</td><td>Fisher Scientific</td><td>22456880</td><td>For nectar-feeding; alternate options can be used</td></tr><tr><td>Defibrinated sheep blood</td><td>Hemostat Laboratories</td><td>DSB100</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Drosophila CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; fly pad</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Fluorescein</td><td>MilliporeSigma</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence plate-reader</td><td>ThermoFisher</td><td>VL0000D0</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Gamma-globulin (human blood)</td><td>MilliporeSigma</td><td>H7379</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Hemoglobin (human)</td><td>MilliporeSigma</td><td>G4386</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wrapping film - parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic stirrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>90-691</td><td>Alternate magnetic stirrers can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge for 96-well plate</td><td>VWR</td><td>80094-180</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes</td><td>MilliporeSigma</td><td>2236412</td><td>Alternate options can be used</td></tr><tr><td>Pellet pestle grinder</td><td>VWR</td><td>KT749521-1500</td><td>Not required if using bead mill homogenizer</td></tr><tr><td>Phosphate buffered solution (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-516F</td><td>Optional</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>Alternate options can be used, such as a lathe for better consistency of cutting</td></tr><tr><td>Rubber bands</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>McMaster Carr</td><td></td><td>Needed if using a fly pad for CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; delivery</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Stir bars</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512</td><td>Alternate magnetic stir bars can be used</td></tr><tr><td>Translucent polypropylene storage box with removable lid</td><td></td><td></td><td>Example box used for feeding assays shown</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td></td><td></td><td>Alternate heating device may be used</td></tr><tr><td>White 0.8 mm polyester mosquito netting</td><td>American Home &amp;amp; Habit Inc.</td><td>F03A-PONO-MOSQ-M008-WT</td><td>Alternate options can be used</td></tr></tbody></table>

feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in aedes aegypti mosquitoes

特定の蚊種のメスは、卵の発達に必要なタンパク質が豊富な血液食事を得るために脊椎動物の宿主を噛みながら病気を広めることができます。実験室では、研究者は、食事組成の操作を可能にする膜フィーダーを介して蚊に動物由来および人工血液食事を提供することができます。ここでは 、Aedes aegypti 蚊に血液および人工血液食事を供給し、個々の女性が消費する量を定量化する方法を提示する。
人工的/血液食事の標的餌と定量化は、食事成分が蚊の行動や生理学に及ぼす影響のテスト、注射なしで薬理学的化合物を提供すること、蚊を特定の病原体に感染させるなど、幅広い用途を持っています。摂食前にフルオレセイン染料を食事に加えることにより、その後の食事サイズの定量が可能になります。蚊が消費する食事量は、体重、後で女性を行動実験に使用する場合、または96ウェルプレートの個々のメスを均質化し、プレートリーダーをエンドポイントアッセイとして使用して蛍光レベルを測定することによって測定することができます。食事サイズの定量化は、食事成分を変更すると摂取される食事量が変化するか、または食事の消費量が蚊の株によって異なるかどうかを決定するために使用することができます。正確な食事サイズの定量は、宿主の魅力や胎児性に対する影響を測定するような下流アッセイにとっても重要です。ここで提示される方法は、日の経過とともに食事の消化を追跡したり、異なる食事(蜜や血液など)に追加された複数の識別可能なマーカーを含むようにして、各食事の消費量を単一の蚊によって定量化するようにさらに適応することができる。
これらの方法により、研究者は単独でハイスループット測定を行い、何百もの個々の蚊が消費する食事量を比較することができます。したがって、これらのツールは、多様な生物学的質問に答えるために蚊の研究者のコミュニティに広く役立ちます。

図1 はGlytubeを組み立てる模式図を示し、図 2 は、ここで説明する蛍光ベースのアッセイを用いて食事サイズを測定する実験計画の概要を示している。 図3 は、血液供給実験からの代表的なフルオレセイン食事サイズ測定を提供する。 図 4、 図 5、および 図 6 は、このプロトコルを使用して対処できる生物学的な質問のサンプルを示しています。プロトコルの用途は広範囲に及び、血液食事組成の変化、薬理学的化合物の摂食、最適でない血液食事または小さな蜜食事の正確な定量化、蚊の遺伝子型にわたる摂食行動の比較が含まれる。
食事量計算のための標準曲線を生成するために、蛍光測定値は、それぞれ0.002%フルオレセインを有する未供給の蚊および既知の食事量を含む指定された基準ウェルからプロットされる(図3A)。残りの井戸からの蛍光測定値は、未収蚊の陰性対照群または食事を提供した蚊の実験群のいずれかから蚊を含み、各蚊が消費する食事量(μL)を定量化するためにこの標準曲線と比較される(図3B)。このアッセイのベースライン測定値を検証するには、未供給の陰性対照群の蚊にμL消費の正の値が割り当てられないことを確認する必要があります(図3B、左)。実験群の全ての女性が血液の食事を提供されたが、一部の蚊は餌を与えた(図3B、中間)、いくつかは食べなかった(図3B、右)。この結果は、このプロトコルから2種類のデータを得ることができることを示しています:1)与えられた食事を食べる女性全体の割合と、2)与えられた食事を食べる女性が摂取した体積。
このプロトコルは、様々なタンパク質組成物を含む食事を送達し、定量化するために使用できます。 図4A,Bは、 フッ素を添加した食事を用いて収集したデータを示す。餌を与えた蚊の割合と摂取した食事量は、それぞれ蛍光測定値から計算した。これらの測定値は非常に感度が高く、μLの正確な定量化が可能ですが、蚊は将来のライブ実験には使用できないという制限があります。 図4C,Dは、 フルオレセインなしで食事を提供された後に、蚊に餌を与えられたり、目で食べられないとスコア付けされた蚊を用いた独立した実験から収集されたデータを示している。食事の大きさは、5匹の蚊の群から平均体重/メスとして計算した。これらの重量測定は蛍光測定よりも感度が低いが、女性を回収し、さらなる生実験に使用することを可能にする。蚊の餌を与える割合は、実験日によって異なる可能性があります( 図 4A および 図 4Cに示すように)。
図5 は、蚊の宿主を求める行動を調節する薬物を含む食事の消費量を示す。これらの実験では、女性は、ヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338の100μMを有する血液、生理食類+ATP、または生理食物+ATP食事を提供した。この薬物は 、Ae. aegypti NPY様受容体7の活性化を通じて宿主を求める行動を変える。食事のサイズを測定することは、研究者が各女性が消費する用量を計算することを可能にするので、この薬物が血液後摂食行動に及ぼす影響を評価する実験の解釈にとって重要である。
前の例では、女性は血液または代替血液の食事を与えられ、その結果、3〜5μLの食事が生まれました(図3、図4、図5)。この蛍光ベースのアッセイは、平均グループ体重測定から正確に識別できない、より小さく、より可変的な食事サイズを測定するためにも使用できます。図6では、0.002%フルオレセインを含む10%スクロースで飽和した綿球に対してGlytubeを交換して蜜送り行動を測定するために、同じ蛍光定量プロトコルを使用した。女性はスタイレットで蜜糖の存在を検出できず、摂食を開始しないため、Glytubeアッセイではネクター糖を提示することはできません。これらのデータにより、研究者は、前の研究34(図6)と一致して、砂糖の食事が血液の食事よりも一貫して小さいことを決定することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2.png"> 図1:蚊に食事を与えるために使用されるGlytube法の設定。(A) 蚊に血液やその他の食事を供給するために使用される分解されたGlytubeの模式図。(B) Glytube の模式図は、メッシュの蓋をした蚊の容器の上に提示した。メスの蚊は、餌を与えるためにメッシュ蓋を通して突き刺すことができます。(C)グリチューブ(上)と雌の Aedes aegypti 蚊の写真は、グリチューブが配達した食事の前、中、および後(下、左から右)に餌を与えた後である。蚊は、膜フィーダーにアクセスするために容器を覆うメッシュを通して突き刺さって示されています。(D) 餌を与えず、人工血液の食事(右、上)または生理食費+ATPミール(右、下)のいずれかに夢中になっている雌の Ae.aegypti 蚊の外観を示す写真。Glytube 法は以前にコスタダ・シルバら (2013)20で出版された。写真(C)と(D)はアレックス・ワイルドの礼儀です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig1v2large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4.png"> 図2:Glytubeの採血プロトコル後の食事サイズを定量化する方法の概略図。(A)蚊はフルオレセイン(上、実験群)または食事なし(下、未供給の陰性対照群)の食事を提供される。(B)餌付け実験を終了した後、96ウェルプレートに個々の蚊を加える。(C)標準曲線は、0.002%フルオレセインを含む既知の量の食事を使用して生成される。(D) 蚊は、消費された蛍光を放出するために均質化され、各ウェルの蛍光レベルはプレートリーダーを用いて定量化される。この蛍光定量法は、Lieschら(2013)34から修飾される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig2v4large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig3v2.png"> 図3:フルオレセインベース定量によるグリチューブ給餌実験(A) 未供給の対照群から得られた、0.002%フルオレセイン(y軸スケール=任意の単位)を含む既知の量の食事に添加された井戸から得られる標準曲線測定。(B)未供給対照群の女性の蛍光測定値(左、黒、n=40)、血液を与えた実験群(中、赤、n=37)、および血液を食べなかった実験群(右、赤、n=23)を用いて計算した食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p<0.01をテストします。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig3v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig4v2.png"> 図4:タンパク質組成が異なる食事の定量化女性は、羊の血液(赤)、ヒト血液タンパク質を有する人工血液(コーガン(1990)22)(オレンジ)、またはタンパク質フリーの生理食動物+ATPミール(アクア)7のいずれかの食事を提供した。(A) 蛍光測定値を用いて採点された女性の割合。各ポイントは12~16人の女性のグループを表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(B)蛍光測定値を用いて計算した食事量。各ポイントは、図4Aからの単一の試験における個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。(C) 人工膜供給後に完全に充満した女性の割合は、目で採点される。各ポイントは、20~30人の女性のグループから集まった女性の割合を表します。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。(D) 給餌状態が目で採点された後、体重/女性として採点された食事サイズ。体重は5つの蚊の群の平均として計算した。データは、範囲 n = 23 の中央値として表示されます。A–D: 文字は統計的に異なるグループを示し、 Kruskal-Wallis 検定とダンの多重比較、 p<0.05.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig4v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig5v2.png"> 図5:薬理化合物による食事の定量化メスは、同じ大きさの羊の血液(赤)、生理食い+ ATP(アクア)、および生理食類+ATP + 100 μM用量のヒトNPY Y2受容体アゴニストTM30338(ダークブルー)の食事を消費する。蛍光測定値を用いて計算された食事量。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲 n = 12 の中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループを示し、クリュスカル・ウォリスはダンの多重比較、p<0.05をテストします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig5v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61835/61835fig6v2.png"> 図6:小さい蜜の食事の定量化。(A) 蜜送りアッセイの概略図。(B)野生型メスの蛍光測定値を用いて計算された食事量は、水(青、n=36)または10%スクロース(緑、n=53)の食事を提供し、それぞれ0.002%フルオレセインを含む、蜜供給アッセイで提供した。各ポイントは、個々の女性からの測定値を表します。データは、範囲を持つ中央値として表示されます。文字は統計的に異なるグループ、マン・ホイットニー検定、p<0.05を示します。これらのデータは、Jovéら(2020)27で公開されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61835/61835fig6v5large.png" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">人工血液の食事</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mg/mL)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">タンパク質成分*</td>
		</tr>
<tr>
<td>γグロブリン</td>
			<td>50</td>
			<td>300</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>ヘモグロビン</td>
			<td>35</td>
			<td>230</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>アルブミン</td>
			<td>300</td>
			<td>340</td>
			<td>102</td>
		</tr>
<tr>
<td>総タンパク質</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">非タンパク質成分</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>5-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>γグロブリン在庫で</td>
			<td>-</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>125</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">※タンパク質成分は、400 mM NaHCO3 に溶解し、可変量のNaCl(2-4%)を含むγグロブリンを除き、二重蒸留水のストック溶液に調製される製品に含まれる。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:人工血液の食事を準備するためのレシピ(コーガン(1990)から適応22)。人工血液は、ヒトの血液中に定期的に見られるタンパク質および非タンパク質成分で構成され、これらの成分の比率を変化させるオプションを提供する。蚊は人工血液7、22を食べた後に卵を作り出すことができます。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">生理食いの食事</td>
		</tr>
<tr>
<td>コンポーネント</td>
			<td>ストック溶液の濃度(mM)</td>
			<td>食事中のストックソリューションの量 (μL/mL)</td>
			<td>最終食事濃度(mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化 ナトリウム</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>ナフコ3
</td>
			<td>400</td>
			<td>300</td>
			<td>120</td>
		</tr>
<tr>
<td>Atp</td>
			<td>200</td>
			<td>5</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td>-</td>
			<td>695</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>表2:ATPによる生理食用のレシピ(デュヴァルらから適応(2019)7)。タンパク質フリーの生理食動物の食事は、血液を摂食した後に起こる腹部の膨満を模倣しながら、蚊に関心のある化合物を提供するために使用することができますが、タンパク質を摂取したときに発生する卵の発達を引き起こすことなく。

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Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

このプロトコルの目標は、人工膜フィーダーを介して Aedes aegypti 蚊に動物由来および人工血液食事を提供し、摂取される食事の量を正確に定量することです。

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

feeding-quantifying-animal-derived-blood-artificial-meals-aedes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

7.7K ビュー.  The Rockefeller University. このプロトコルの目標は、人工膜フィーダーを介して Aedes aegypti 蚊に動物由来および人工血液食事を提供し、摂取される食事の量を正確に定量することです。

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Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

免疫・感染学

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

生物学

Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are delivered using a non-quantitative method. Accurate delivery of known quantities of nucleic acids or other chemicals is critical to measure the efficacy of the compound being tested and to allow reliable comparison between compounds.
Here we provide a reproducible, quantitative microinjection protocol that ensures accurate delivery of specific doses of dsRNA, reducing the mortality typically induced by injection injury. These modifications include the addition of Rhodamine B, a graduated injection needle, and an improved recovery method borrowed from Isoe and Collins. This method allows calculation of dose responses and facilitates comparisons between compounds. Versions of this method have been successfully used on three genera of mosquitoes as well as house flies to assess the reduction in fecundity resulting from gene silencing of ribosomal RNA transcripts.
This protocol provides strategies to reduce several challenges of small insect microinjection. Together, mechanical delivery of dsRNAs accompanied by visual verification, identification of effective locations for delivery, and inclusion of a post-injection recovery period ensure accurate dosing and low injury mortality. This protocol also describes an oviposition bioassay for uniform determination of effects on fecundity.

This protocol describes a microinjection methodology that we have standardized and used for several years to deliver specific quantities of nucleic acids directly to the hemolymph of mosquitoes and house flies. This protocol results in minimal injection mortality and allows dose correlated measurements of fecundity.

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

Synthetic dsRNAs, used to induce RNA interference, may have dose dependent phenotypic effects. These effects are difficult to define if the dsRNAs are ...

環境学

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable production of mosquitoes is currently inhibited by the supply of fresh vertebrate blood. Alternatives to blood are required to promote efficient control strategies for malaria and other vector borne diseases that are transmitted by blood feeding insects. With this in mind, artificial liquid diets were formulated as substitutes for fresh vertebrate blood. Herein we report a blood-free artificial liquid diet that delivers feeding rates similar to blood and mimics the physiological effects of a fresh vertebrate blood meal. The diet induces ovarian and egg maturation of Anopheles mosquitoes and also produces good larval survival and development of functional adults. The formulated blood-free liquid diet is an important advance towards sustainable mosquito breeding in captivity and will reduce the maintenance costs of mosquito colonies and eliminate the need for fresh vertebrate blood.

A protocol is presented for formulation of a blood-free artificial diet to feed Anopheles mosquitoes in captivity. This diet has a similar performance to vertebrate blood and triggers oogenesis and egg maturation and produces viable adult progeny.

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

Malaria research requires large-scale breeding and production conditions for mosquitoes (Anopheles spp.) in captivity. The sustainable and reliable ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life parameter data from genetically modified mosquitoes and comparing them to mosquitoes lacking transgenes from the same genetic background. This manuscript illustrates how to measure common life history traits in the mosquito Aedes aegypti, including fecundity, wing size and shape, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These parameters were chosen because they reflect reproductive success, are simple to measure, and are commonly reported in the literature. The representative results quantify fitness costs associated with either a gene knock-out or a single insertion of a gene drive element. Standardizing how life parameter data are collected is important because such data may be used to compare the health of transgenic mosquitoes generated across studies or to model the transgene fixation rate in a simulated wild-type mosquito population. Although this protocol is specific for transgenic Aedes aegypti, the protocol may also be used for other mosquito species or other experimental treatment conditions, with the caveat that certain biological contexts may require special adaptations.

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

The present protocol describes how to measure common life parameter data in Aedes aegypti mosquitoes, including fecundity, wing size, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These measurements can be used to assess the fitness of transgenic mosquitoes.

トランスジェニック ネッタイシマカ の適応コストの定量化

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

要約

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アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

トランスジェニックネッタイシマカの適応コストの定量化

アエデスアエジプティ蚊の動物由来血液と人工食事の摂食と定量化

要約

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アルファウイルス形質導入システム：蚊で感染を可視化するためのツール

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊の ベクターコンピテンス分析

経口摂食とマイクロインジェクションによる成体蚊の実験的ウイルス感染

蚊のベクトル能力を分析する方法として唾液の分泌を強制

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

24ウェル組織培養プレート(EAgaLプレート)を用いた Aedes aegypti のフェクアンディティと不妊治療アッセイの改善

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

トランスジェニック ネッタイシマカ の適応コストの定量化

ジカウイルスを用いた Aedes aegypti蚊のベクターコンピテンス分析

トランスジェニックネッタイシマカの適応コストの定量化