La méthode est relativement simple et permet une édition efficace des gènes des cellules B du macaque rhésus. La méthode permet de tester des cellules B génétiquement modifiées à des fins thérapeutiques chez les macaques rhésus. Il convient également à la recherche préclinique sur la thérapie par cellules B.
La méthode générale peut être adaptée à d’autres types de cellules. Si la procédure est suivie correctement, il ne faut pas s’attendre à des luttes. Cependant, l’efficacité de la coupe de l’ARNg et un lot de bonne qualité de gabarit recombinant AAV6 sont essentiels.
Pour commencer, préchauffez le milieu de culture de cellules B dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Décongeler les stimulants des cellules B sur la glace. Préparez un tube de taille appropriée contenant un milieu de décongélation préchauffé.
Décongeler un à deux flacons de splénocytes de macaque rhésus primaire ou PBMC dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Décanter les splénocytes dans le tube préparé contenant un milieu de décongélation préchauffé. Rincez les cryotubes pour recueillir toutes les cellules.
Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 millilitres de milieu de décongélation pour le lavage. Répétez les centrifugations trois fois pour éliminer le milieu de congélation.
Après la dernière centrifugation, remettre les cellules en suspension à environ cinq fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu de culture de cellules B. Combinez 10 microlitres de suspension cellulaire avec 10 microlitres de bleu trypan à 0,4% et comptez les cellules sur un hémocytomètre. Ajustez la concentration cellulaire à trois fois 10 à six cellules par millilitre avec le milieu de culture de cellules B en fonction du nombre de cellules.
Ensuite, ajoutez les stimulants des cellules B à leurs concentrations finales et mélangez. Transférez les cellules dans une boîte de culture cellulaire et incuberez-les à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. Après l’installation, les cellules devraient former une monocouche dense et de petits amas de cellules peuvent déjà être visibles.
Après environ deux jours, les cellules devraient être saines, irrégulières et avoir formé des amas visiblement plus grands. Après avoir activé les cellules B, préparez les réactifs pour l’électroporation et la transduction. Préchauffez le tampon duplex sans nucléase DMSO, le tampon T et le tampon E ou E2 du kit d’électroporation à température ambiante.
Décongelez le modèle de réparation dirigée par homologie rAAV6, ou HDRT, et les stimulants des cellules B sur la glace. Resuspendre l’ARN monoguide CRISPR Cas9, ou sgRNA, à 100 micromolaires dans un tampon duplex. Reconstituer pendant 10 minutes à température ambiante et mélanger par tourbillon et effleurement.
Placer l’ARNg reconstitué sur de la glace jusqu’à utilisation. Pour l’électroporation de 10 microlitres, préparez 550 microlitres de milieu de culture de cellules B avec des stimulants et 1% de DMSO. Ajoutez 50 microlitres de ce milieu avec ou sans antibiotiques dans une plaque de culture cellulaire de 48 puits.
Ensuite, ajoutez rAAV6 HDRT au milieu dans les puits, jusqu’à 20% du volume du puits. Préchauffer le plat préparé et le milieu restant dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Ensuite, pour l’électroporation de 10 microlitres, préparez 1,15 microlitre de ribonucléoprotéine, ou RNP, en mélangeant 0,4 microlitre de Cas9 61 micromolaires avec 0,75 microlitre d’ARNg de 100 micromolaires dans un tampon duplex.
Incuber le RNP pendant 15 minutes à température ambiante avant de le mélanger avec les cellules. Après l’incubation, plusieurs RNP peuvent être combinés si plus d’un locus doit être ciblé simultanément. Ensuite, préparez les cellules pour l’électroporation.
Laissez les cellules à température ambiante pour éviter les chocs de température. Après l’incubation, récoltez les cellules dans un récipient approprié. Rincez le plat avec DPBS pour recueillir le maximum de cellules.
Centrifuger les cellules à 200 G pendant 10 minutes. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le DPBS à environ deux fois 10 à six cellules par millilitre, en fonction du nombre de cellules mises dans la culture. Combinez des volumes égaux de suspension cellulaire et de bleu de trypan à 0,4% et comptez à l’aide d’un hémocytomètre.
Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, remettre les cellules en suspension dans le tampon T préchauffé à 5,55 fois 10 à sept cellules par millilitre, en fonction du nombre de cellules. Configurez le système de transfection en allumant la machine et en la réglant sur 1 350 volts, 15 millisecondes et une impulsion. Placez la pipette à l’intérieur de la hotte à flux laminaire.
Pour chaque jeu de 10 électroporations, préparez un tube de transfection avec trois millilitres de tampon E.Insérez le tube dans la station de pipette. Combinez 1,15 microlitre de RNP avec neuf microlitres de cellules par électroporation. Préparez au moins 20% de plus pour éviter les bulles et incuber à température ambiante pendant une minute avant l’électroporation.
Aspirer 10 microlitres de RNP et de mélange cellulaire dans l’embout d’électroporation d’une pipette d’électroporation. Insérez la pipette chargée dans la station de pipette et démarrez l’électroporation. Assurez-vous que les embouts sont complètement exempts de bulles d’air pour éviter les arcs électriques.
Éjecter immédiatement les cellules électroporées dans le petit volume de milieu préchauffé préparé, avec ou sans rAAV6, à l’intérieur du puits 48. Ajouter des échantillons témoins sans transfection dans les puits de culture. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant quatre à six heures.
À la fin de l’incubation, ajouter 450 microlitres de milieu de culture de cellules B préchauffé contenant des stimulants, du DMSO, et avec ou sans antibiotiques dans la plaque. Effectuer une analyse de l’ADN génomique après 24 heures. Quantifier l’efficacité d’édition avec la réaction en chaîne de la polymérase numérique gouttelette, ou PCR, en utilisant une amorce à l’extérieur du bras d’homologie et une amorce à l’intérieur de l’insert.
Effectuez la PCR pour amplifier le site d’insertion et le séquençage de Sanger pour vérifier l’édition correcte. Pour analyser les niveaux de protéines, cultiver les cellules pendant 40 à 48 heures après l’électroporation pour permettre des changements d’expression des protéines et effectuer une analyse par cytométrie en flux. La production de rAAV6 à l’aide d’un auxiliaire adénoviral auto-silencieux activé par la tétracycline a entraîné la production de quatre fois 10 à 10 GC par millilitre de milieu de culture cellulaire, surpassant la production en utilisant une triple transfection sans aide de 30 à 40 fois.
La purification facultative a permis d’éliminer la majorité des lymphocytes T CD3+ et des lymphocytes myéloïdes CD14+et CD16+, avec des puretés de 80 à 95 % de cellules CD20+B obtenues régulièrement. L’édition de gènes de cellules primaires de macaque rhésus B est illustrée ici. Cette étude a maintenu une viabilité cellulaire élevée, tout en supprimant simultanément l’expression de la chaîne légère dans les cellules 80% B.
La majorité des lymphocytes B exprimaient encore l’isotype IgM. L’ajout de rAAV6 codant pour l’anticorps 1485 HDRT a entraîné l’édition de gènes et l’expression de surface de l’anticorps 1485 dans 16 à 21% des cellules B, bien qu’à une intensité de fluorescence plus faible pour les chaînes d’anticorps que sur les cellules B non éditées. L’ajout de 1 % de DMSO et d’incubations étendues et concentrées avec le rAAV6 HDRT a généralement augmenté l’efficacité du montage.
En utilisant cette méthode, une efficacité d’édition généralement de cinq à 20% et jusqu’à 40% a été atteinte, en fonction du macaque rhésus individuel et de la qualité du lot rAAV6 HDRT. Lors de l’électroporation, assurez-vous d’avoir suffisamment de mélange pour la transfection et il n’y a pas de bulles dans la pointe. Les cellules peuvent être analysées par n’importe quelle méthode souhaitée ou un transfert autologue dans le macaque rhésus donneur peut être effectué.
