Метод относительно прост и позволяет эффективно редактировать гены В-клеток макак-резусов. Метод позволяет тестировать генно-отредактированные В-клетки в терапевтических целях у макак-резусов. Он также подходит для доклинических исследований В-клеточной терапии.
Общий метод может быть адаптирован для других типов клеток. Если процедура соблюдается правильно, не следует ожидать борьбы. Однако, поскольку эффективность резки гРНК и партия рекомбинантного шаблона AAV6 хорошего качества имеют решающее значение.
Для начала предварительно подогрейте питательные среды В-клеток на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Разморозьте стимуляторы В-клеток на льду. Подготовьте трубку соответствующего размера, содержащую предварительно подогретую размораживающую среду.
Разморозьте один-два флакона первичных спленоцитов макак-резусов или PBMC на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия. Сцедите спленоциты в подготовленную пробирку, содержащую предварительно подогретую талую среду. Промойте криотрубки, чтобы собрать все клетки.
Центрифугируют клетки при 200 G в течение 10 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 10 миллилитрах талой среды для промывки. Повторите центрифугирование три раза, чтобы удалить замерзающую среду.
После последнего центрифугирования ресуспендируют клетки примерно в количестве от 10 до шести клеток на миллилитр в питательной среде В-клеток. Смешайте 10 микролитров клеточной суспензии с 10 микролитрами 0,4% трипанового синего и подсчитайте клетки на гемоцитометре. Отрегулируйте концентрацию клеток в три раза от 10 до шести клеток на миллилитр с питательной средой В-клеток в соответствии с количеством клеток.
Затем добавьте стимуляторы В-клеток к их конечным концентрациям и перемешайте. Перенесите клетки в чашку для клеточных культур и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение 48 часов. После оседания клетки должны образовать плотный монослой и уже могут быть видны небольшие скопления клеток.
Примерно через два дня клетки должны быть здоровыми, нерегулярными и образовывать заметно большие скопления. После активации В-клеток подготовьте реагенты для электропорации и трансдукции. Предварительно разогрейте безнуклеазный дуплексный буфер ДМСО, буфер T и буфер E или E2 из набора для электропорации до комнатной температуры.
Разморозьте шаблон репарации, направленный на гомологию rAAV6, или HDRT, и стимуляторы В-клеток на льду. Ресуспендируйте однонаправляющую РНК CRISPR Cas9, или сгРНК, на 100-микромолярном в дуплексном буфере. Восстановите в течение 10 минут при комнатной температуре и перемешайте путем вихряния и щелчка.
Поместите восстановленную сгРНК на лед до использования. Для 10-микролитровой электропорации приготовьте 550 микролитров среды для культивирования В-клеток со стимуляторами и 1%-ным ДМСО. Добавьте 50 микролитров этой среды с антибиотиками или без них в 48-луночную тарелку для культивирования клеток.
Затем добавьте rAAV6 HDRT в среду в скважинах, до 20% от объема скважины. Предварительно разогрейте подготовленное блюдо и оставшуюся среду в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия с 5%-ным углекислым газом. Затем для 10-микролитровой электропорации приготовьте 1,15 микролитра рибонуклеопротеина, или РНП, смешав 0,4 микролитра 61-микромолярного Cas9 с 0,75 микролитра 100-микромолярной сгРНК в дуплексном буфере.
Инкубируйте RNP в течение 15 минут при комнатной температуре, прежде чем смешивать его с клетками. После инкубации несколько RNP могут быть объединены, если необходимо одновременно нацеливаться на более чем один локус. Далее подготавливают клетки к электропорации.
Оставьте клетки при комнатной температуре, чтобы избежать температурных скачков. После инкубации заготавливают клетки в соответствующий сосуд. Промойте посуду DPBS, чтобы собрать максимальное количество ячеек.
Центрифугируют клетки при 200 г в течение 10 минут. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клетки в DPBS примерно в два раза от 10 до шести клеток на миллилитр, в зависимости от количества клеток, помещенных в культуру. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% трипанового синего и подсчитайте с помощью гемоцитометра.
После центрифугирования и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендируют клетки в предварительно подогретом буфере T в соотношении 5,55 к 10 до семи клеток на миллилитр в зависимости от количества клеток. Настройте систему трансфекции, включив машину и установив ее на 1 350 вольт, 15 миллисекунд и один импульс. Поместите дозаторную станцию внутрь вытяжного шкафа с ламинарным потоком.
Для каждого набора из 10 электропораций подготовьте трансфекционную трубку с тремя миллилитрами буфера E. Вставьте пробирку в пипетку. Объедините 1,15 микролитра RNP с девятью микролитрами клеток на электропорацию. Приготовьте как минимум на 20% больше, чтобы избежать пузырьков, и инкубируйте при комнатной температуре в течение одной минуты перед электропорацией.
Аспирируйте 10 микролитров РНП и клеточной смеси в электропорационный наконечник на электропорационной пипетке. Вставьте загруженную дозатор в дозатор и запустите электропорацию. Убедитесь, что наконечники полностью свободны от пузырьков воздуха, чтобы предотвратить искрение.
Немедленно вытолкните электропорированные ячейки в подготовленный предварительно нагретый небольшой объем среды, с rAAV6 или без него, внутри 48-лунки. Добавьте контрольные образцы без трансфекции в культуральные лунки. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа в течение четырех-шести часов.
В конце инкубации добавьте в пластину 450 микролитров предварительно подогретой среды для культивирования В-клеток, содержащей стимуляторы, ДМСО, а также с антибиотиками или без них. Проведите геномный анализ ДНК через 24 часа. Количественно оцените эффективность редактирования с помощью цифровой капельной полимеразной цепной реакции или ПЦР с использованием праймера за пределами плеча гомологии и праймера внутри вставки.
Выполните ПЦР для амплификации места вставки и секвенирование по Сэнгеру, чтобы проверить правильность редактирования. Чтобы проанализировать уровень белка, культивируйте клетки в течение 40-48 часов после электропорации, чтобы обеспечить изменения экспрессии белка, и выполните анализ с помощью проточной цитометрии. Производство rAAV6 с использованием самоподавляющего аденовирусного хелпера с поддержкой тетрациклина привело к получению в четыре раза от 10 до 10 ГК на миллилитр среды для культивирования клеток, что в 30-40 раз превосходило производство с использованием тройной трансфекции без помощников.
Необязательная очистка привела к элиминации большинства CD3 + Т-клеток и CD14 + и CD16 + миелоидных клеток с чистотой от 80 до 95% CD20 + B-клеток. Здесь показано редактирование генов первичных В-клеток макак-резусов. Это исследование поддерживало высокую жизнеспособность клеток, одновременно удаляя экспрессию легкой цепи в 80% В-клеток.
Большинство В-клеток по-прежнему экспрессируют изотип IgM. Добавление rAAV6, кодирующего антитело 1485 HDRT, привело к редактированию генов и поверхностной экспрессии антитела 1485 в 16-21% В-клеток, хотя и с более низкой интенсивностью флуоресценции для цепей антител, чем на неотредактированных В-клетках. Добавление 1% ДМСО и расширенная концентрированная инкубация с rAAV6 HDRT обычно повышали эффективность редактирования.
С помощью этого метода, как правило, достигалась эффективность редактирования от пяти до 20% и до 40%, в зависимости от отдельной макаки резуса и качества партии rAAV6 HDRT. Выполняя электропорацию, убедитесь, что у вас достаточно смеси для трансфекции и нет пузырьков в наконечнике. Клетки могут быть проанализированы любым желаемым методом или может быть выполнен аутологичный перенос в донорскую макаку-резус.
