原代恒河猴B细胞的基因编辑

该方法相对简单，可以对恒河猴B细胞进行有效的基因编辑。该方法允许测试基因编辑的B细胞用于恒河猴的治疗目的。它也适用于临床前B细胞治疗研究。

一般方法可以适用于其他细胞类型。如果正确遵循程序，则不应期望进行斗争。然而，由于gRNA切割效率和一批高质量的重组AAV6提供模板至关重要。

首先，在37摄氏度的水浴中预热B细胞培养基。在冰上解冻B细胞兴奋剂。准备一个适当大小的管子，其中包含预热的解冻培养基。

在 37 摄氏度的水浴中解冻一到两瓶原代恒河猴脾细胞或 PBMC。将脾细胞倒入含有预热解冻培养基的制备管中。冲洗冷冻管以收集所有细胞。

在室温下以200G离心细胞10分钟。弃去上清液并将细胞重悬于10毫升解冻培养基中洗涤。重复离心三次以除去冷冻培养基。

最后一次离心后，将细胞重悬于B细胞培养基中，估计为每毫升6个细胞的5倍10至6个细胞。将10微升细胞悬液与10微升0.4%台盼蓝混合，并在血细胞计数器上计数细胞。根据细胞计数，用B细胞培养基将细胞浓度调节至每毫升6个细胞的3倍10至6个细胞。

然后，将B细胞兴奋剂添加到其最终浓度并混合。将细胞转移到细胞培养皿中，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育48小时。沉淀后，细胞应形成致密的单层，并且可能已经可以看到小的细胞簇。

大约两天后，细胞应该是健康的，不规则的，并且已经形成了明显更大的簇。激活B细胞后，准备用于电穿孔和转导的试剂。将DMSO无核酸酶双链缓冲液、缓冲液T和缓冲液E或E2从电穿孔试剂盒预热至室温。

在冰上解冻rAAV6同源定向修复模板或HDRT和B细胞兴奋剂。将 CRISPR Cas9 单向导 RNA 或 sgRNA 重悬在双链缓冲液中，浓度为 100 微摩尔。在室温下复溶10分钟，并通过涡旋和轻弹混合。

将重组的sgRNA放在冰上直至使用。对于10微升电穿孔，用兴奋剂和1%DMSO制备550微升B细胞培养基。将50微升含或不含抗生素的该培养基加入48孔细胞培养板中。

然后，将rAAV6 HDRT添加到孔中的培养基中，最高可达孔体积的20%。将准备好的培养皿和剩余培养基在 37 摄氏度的培养箱中用 5% 二氧化碳预热。接下来，对于 10 微升电穿孔，通过在双链缓冲液中将 0.4 微升 61 微摩尔 Cas9 与 0.75 微升 100 微摩尔 sgRNA 混合来制备 1.15 微升核糖核蛋白或 RNP。

将RNP在室温下孵育15分钟，然后将其与细胞混合。孵育后，如果要同时靶向多个位点，则可以组合多个RNP。接下来，准备用于电穿孔的细胞。

将细胞置于室温下以避免温度冲击。孵育后，将细胞收获到适当的容器中。用DPBS冲洗培养皿以收集最大数量的细胞。

将细胞以200 G离心10分钟。弃去上清液，并根据放入培养物中的细胞数量，将细胞重悬于DPBS中，大约乘以10至每毫升6个细胞。将等体积的细胞悬液和0.4%台盼蓝混合，并使用血细胞计数器计数。

离心并弃去上清液后，根据细胞计数，将细胞重悬于预热的缓冲液T中，以5.55乘以10至每毫升7个细胞。通过打开机器并将其设置为1、350伏、15毫秒和1脉冲来设置转染系统。将移液器站放在层流罩内。

对于每组10个电穿孔，准备一个带有3毫升缓冲液的转染管E.将管插入移液器站。每次电穿孔将 1.15 微升 RNP 与 9 微升细胞混合。准备至少20%以上以避免气泡，并在电穿孔前在室温下孵育一分钟。

将10微升RNP和细胞混合物吸入电穿孔移液器上的电穿孔尖端中。将装入的移液器插入移液器站并开始电穿孔。确保吸头完全没有气泡，以防止电弧。

立即将电穿孔细胞喷射到48孔内制备的预热的小体积培养基中，有或没有rAAV6。将对照样品不转染添加到培养孔中。将细胞在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育四到六个小时。

在孵育结束时，将450微升含有兴奋剂，DMSO和有或没有抗生素的预热B细胞培养基加入板中。24小时后进行基因组DNA分析。使用同源臂外的引物和插入片段内的引物，通过数字液滴聚合酶链反应（PCR）量化编辑效率。

进行PCR扩增插入位点和Sanger测序以验证正确的编辑。为了分析蛋白质水平，在电穿孔后培养细胞40至48小时以允许蛋白质表达变化，并通过流式细胞术进行分析。使用启用四环素的自沉默腺病毒辅助剂生产rAAV6，每毫升细胞培养基产生4倍10至10 GC，比使用无辅助三重转染生产高出30至40倍。

可选的纯化导致消除了大多数CD3 + T细胞以及CD14 +和CD16 +骨髓细胞，常规获得80至95%CD20 + B细胞的纯度。原代恒河猴B细胞的基因编辑如图所示。这项研究保持了高细胞活力，同时删除了80%B细胞中的轻链表达。

大多数B细胞仍然表达同种型IgM。添加编码抗体1485 HDRT的rAAV6导致16%至21%的B细胞中的基因编辑和抗体1485表面表达，尽管抗体链的荧光强度低于未编辑的B细胞。添加 1%DMSO 并使用 rAAV6 HDRT 进行扩展的浓缩孵育通常提高了编辑效率。

使用这种方法，通常可实现 5% 到 20% 和高达 40% 的编辑效率，具体取决于单个恒河猴和 rAAV6 HDRT 批次的质量。在进行电穿孔时，请确保有足够的混合物进行转染，并且尖端没有气泡。可以通过任何所需的方法分析细胞，也可以进行自体转移到供体恒河猴中。