真菌ベータグルカンは免疫系の重要なモジュレーターです。純度と分離プロトコルを強化することは、がん治療の補助アジュバントとしての潜在的な役割を主張するために不可欠です。分子生物学やプロテオミクス研究室で一般的に見られるさまざまなデバイスを使用して、4つの異なるベータグルカンの高度な結果が得られました。
このプロトコルは、脳の最も豊富な常在免疫細胞であるミクログリアに対するベータグルカンの効果をテストすることに焦点を当てています。膠芽腫におけるミクログリア表現型を調節することは、重要な洞察をもたらすことができる。可溶性キノコ多糖類またはSMPの抽出を開始するには、ヒラタケ、ヒラタケ、エリナセウス、霊芝の新鮮な子実体を蒸留水で5回すすぎます。
次に、洗浄した子実体を従来の風乾オーブンで摂氏50度で約24時間完全に乾燥させてから、ブレードミルで粉砕し、各キノコから約200グラムの粉末を得ます。次に、100グラムの4つのキノコ粉末すべてまたはMPを1, 000ミリリットルの蒸留水に懸濁し、懸濁液を121°Cで15分間オートクレーブします。室温で30分間インキュベートした後、得られた懸濁液を6, 000Gで4°Cで10分間遠心分離する。
次に、不溶性キノコ多糖類またはIMPを含む沈殿物を、風乾オーブンで摂氏50度で24時間乾燥させます。沈殿物を捨て、ロータリーエバポレーターで上清を10倍濃縮します。次に、SMPを含む濃縮物をエタノールで摂氏4度で一晩沈殿させます。
エタノール懸濁液を6, 000 Gで4°Cで15分間遠心分離した後、上清をピペットで捨て、ペレットを80%エタノールで3回洗浄してから蒸留水を溶解する。pHを6.5〜7に、温度を摂氏37度に調整し、懸濁液をそれぞれ2ユニットおよび4ユニットのα-アミラーゼおよびグルコアミラーゼで処理することにより、α-グルカンを可溶化します。次に、pHを8.0に、温度を摂氏50度に調整し、懸濁液をタンパク質1グラムあたり2.5単位に相当するアルカラーゼで処理することにより、タンパク質を可溶化します。
加水分解後、加水分解液を遠心分離し、上清濃縮液をロータリーエバポレーターで5回洗浄します。80%エタノールを加えて上清濃縮液を再び沈殿させる。低分子量分子を除去するには、沈殿物を蒸留水に可溶化し、12, 000ダルトンカットオフセルロースチューブ膜を使用して蒸留水中で24時間透析します。
水溶性部分を回収し、凍結乾燥して可溶性β-グルカンまたはSβ-Gを生成します。総グルカンとアルファグルカンを別々に評価します。得られたβ-グルカン値を、総グルカン値とα-グルカン値の差として測定します。
UV可視分光光度計を使用してSβ-G UVスペクトルを取得するには、蒸留水中で各Sβ-Gの1ミリリットルあたり1.0ミリグラムを調製します。サンプルを石英キュベットに移し、室温で200〜400ナノメートルの領域でスキャンします。UV 可視検出器と Superdex TM 200 10/300 GL ゲルろ過カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーまたは HPLC システムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーまたは SEC によって、S、β-G、およびポリマーの分子量の均一性を推定します。
フーリエ変換赤外線またはFTIR分光計でサンプルの赤外線スペクトルを4, 000〜500センチメートルの範囲で記録します。BV2ミクログリア細胞を、P.ostreatus、P.djamor、G.lucidum、およびH.erinaceusから単離された4つの異なるベータグルカンの0.2ミリグラム/ミリリットルの濃度で72時間コーティングすることにより、ミクログリアを活性化します。72時間後、ピペットで上清を収集し、残りの容量を0.20マイクロメートルのシリンジフィルターに通します。
次に、上清をマイナス80°Cで少なくとも24時間凍結します。GL 261を事前に活性化したミクログリア馴化培地で処理するには、250マイクロリットルのβ-グルカン処理ミクログリア培地を80%コンフルエントなGL 261細胞に72時間加えます。72時間後に培地を廃棄する。
異なるSβ-GのUVスペクトルは、260および280ナノメートルにUV吸収ピークを示さず、Sβ-Gが核酸およびタンパク質を欠いていることを示している。HPLCクロマトグラムは、P.ostreatusで10.9分、ルシダムで10.5分、P.djamorで11.3分、H.erinaceusで8.20分と、主要なシャープで単一のピークと良好な均質性を示し、フラクションがホモポリマーと一致していることが示唆されました。FTIRスペクトルは、共有多糖結合に対応する分子振動を測定した。
SSβ-Gは、最小限のタンパク質と結合した炭水化物で構成されていることが示されました。HPTLCおよびGC-MSでSβ-Gの単糖プロファイルを解析したところ、大量のD-グルコース、少量のD-ガラクトースとD-マンノース、および微量のD-キシロース、D-ラムノース、D-フコース、およびL-アラビノースの存在が明らかになりました。ImageJソフトウェアの社内スクリプトを使用して、各蛍光チャンネルの正のピクセル数を定量化しました。
このスクリプトは、各蛍光色素の強度の閾値としてコントロールサンプルを使用し、ピクセル数を提供しました。異なる実験条件後の各マーカーの発現を示した。興味深いことに、GL 261は、異なるミクログリア馴化培地への曝露による腫瘍増殖に関して有意差を被らなかった。
しかし、P.djamor と H.erinaceus は、切断されたカスパーゼ-3がそれぞれ約 6 倍と 9 倍に増加するという強い誘導を示しました。このプロトコルでは、ベータグルカンの高純度を確保することが不可欠です。このプロトコルは、分光光度計、HPLCなどの高度な機器を使用します。
または FITR を使用します。これらのツールを使用すると、調査結果の堅牢性が高まります。ミクログリアに対するベータグルカンの効果を自信を持って分析し、より信頼性の高い結果を得ることができます。
時間と世界の制限のために、私たちはプロトコルをミクログリア細胞上のベータグルカンの研究に限定しました。しかしながら、マクロファージまたはT細胞のような免疫系からの他の細胞は、このプロトコールの間に容易に容易にされ得る。初めて、これらのプロトコルは2つの異なる知識分野を組み合わせたものです。
第一に、特定の製品を精製するためのバイオテクノロジー手順の使用、および第二に、それらの免疫調節特性をテストするための細胞培養技術の使用。
