Грибковые бета-глюканы являются важными модуляторами иммунной системы. Совершенствование протоколов чистоты и изоляции имеет важное значение для утверждения их потенциальной роли в качестве соадъювантов для терапии рака. Высокая степень четырех различных бета-глюканов была достигнута с использованием различных устройств, обычно встречающихся в молекулярной биологии и протеомных лабораториях.
Этот протокол фокусируется на тестировании влияния бета-глюканов на микроглию, наиболее распространенную резидентную иммунную клетку мозга. Модуляция фенотипа микроглии при глиобластоме может дать важную информацию. Начните экстракцию растворимых полисахаридов грибов или SMP с ополаскивания свежих плодовых тел Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus и Ganoderma lucidum дистиллированной водой пять раз.
Затем полностью высушите промытые плодовые тела при температуре 50 градусов Цельсия в обычной сушильной печи на воздухе в течение примерно 24 часов, прежде чем измельчить их в лопастной мельнице, получив около 200 граммов порошка от каждого гриба. Затем суспендируйте 100 граммов всех четырех грибных порошков или МП в 1 000 миллилитров дистиллированной воды и автоклавируйте суспензию при температуре 121 градус Цельсия в течение 15 минут. После 30 минут инкубации при комнатной температуре центрифугируют полученную суспензию при 6 000 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Затем высушите осадок, содержащий нерастворимые полисахариды грибов или IMP, при температуре 50 градусов Цельсия в сушильном шкафу на воздухе в течение 24 часов. Выбросьте осадок и 10 раз сконцентрируйте надосадочную жидкость во вращающемся испарителе. Затем осаждайте концентрат, содержащий SMP, этанолом на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.
После центрифугирования суспензии этанола при 6 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия откажитесь от надосадочной жидкости пипеткой и трижды промойте гранулу 80% этанолом перед растворением ее и дистиллированной водой. Отрегулируйте рН до 6,5-7 и температуру до 37 градусов по Цельсию и растворите альфа-глюканы, обработав суспензию двумя единицами и четырьмя единицами альфа-амилазы и глюкоамилазы соответственно. Затем отрегулируйте рН до 8,0 и температуру до 50 градусов по Цельсию и растворите белки, обработав суспензию алкалазой, эквивалентной 2,5 единицам на грамм белка.
После гидролиза центрифугируйте гидролизат и пять раз очистите надосадочный концентрат во роторном испарителе. Снова осаждайте надосадочный концентрат, добавив 80% этанола. Чтобы удалить низкомолекулярные молекулы, растворите осадок в дистиллированной воде и диализируйте его в дистиллированной воде в течение 24 часов, используя мембраны из целлюлозных трубок с отсечкой 12 000 Дальтона.
Извлеките водорастворимую часть и высушите ее вымораживанием для получения растворимых бета-глюканов или S-бета-G. Оцените общее количество глюканов и альфа-глюканов отдельно. Измерьте результирующие значения бета-глюкана как разницу между значениями общего глюкана и альфа-глюкана.
Чтобы получить УФ-спектры S-бета-G с помощью УФ-спектрофотометра в видимом диапазоне, приготовьте 1,0 миллиграмма на миллилитр каждого S beta-G в дистиллированной воде. Перенесите образец в кварцевую кювету и выполните сканирование при комнатной температуре в области от 200 до 400 нанометров. Оцените однородность S, бета-Gs и молекулярную массу полимеров с помощью эксклюзионной хроматографии или SEC с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или системы ВЭЖХ, оснащенной детектором УФ-видимого излучения и гелевой фильтрационной колонкой Superdex TM 200 10/300 GL.
Запишите инфракрасные спектры образца на инфракрасном спектрометре с преобразованием Фурье или ИК-Фурье в диапазоне от 4 000 до 500 сантиметров. Активируйте микроглию, покрывая клетки микроглии BV2 в течение 72 часов концентрацией 0,2 миллиграмма на миллилитр четырех различных бета-глюканов, выделенных из P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum и H.erinaceus. Через 72 часа соберите надосадочную жидкость пипеткой и пропустите оставшийся объем через шприцевой фильтр размером 0,20 микрометра.
Затем заморозьте надосадочную жидкость при температуре минус 80 градусов по Цельсию не менее чем на 24 часа. Для лечения GL 261 предварительно активированной средой, кондиционированной микроглией, добавьте 250 микролитров микроглиальной среды, обработанной бета-глюканом, в 80% сливающиеся клетки GL 261 в течение 72 часов. Выбросьте средство через 72 часа.
УФ-спектры различных S-бета-G не показали пиков поглощения УФ-излучения на 260 и 280 нанометрах, что указывает на то, что в S-бета-Gs отсутствуют нуклеиновые кислоты и белки. Хроматограммы ВЭЖХ показали хорошую однородность с основным острым и единичным пиком через 10,9 минуты для P.ostreatus, 10,5 минуты для lucidum, 11,3 минуты для P.djamor и 8,20 минуты для H.erinaceus, что позволяет предположить, что фракция согласуется с гомополимерами. Спектры FTIR измеряли молекулярные колебания, соответствующие ковалентным полисахаридным связям.
Он показал, что бета-G SS содержит углеводы, конъюгированные с минимальным количеством белка. ВЭТСХ и ГХ-МС, анализирующие моносахаридный профиль S-бета-G, выявили наличие большого количества D-глюкозы, меньших количеств D-галактозы и D-маннозы, а также следов D-ксилозы, D-рамнозы, D-фукозы и L-арабинозы. Используя собственный сценарий в программном обеспечении ImageJ, количество положительных пикселей для каждого флуоресцентного канала было количественно определено.
Скрипт использовал контрольные образцы в качестве порога интенсивности каждого флуорофора и предоставлял количество пикселей. Он указал экспрессию для каждого маркера после различных экспериментальных условий. Интересно, что GL 261 не претерпел существенных различий в отношении пролиферации опухоли при воздействии различных сред, кондиционированных микроглией.
Тем не менее, P.djamor и H.erinaceus показали сильную индукцию примерно шестикратного и девятикратного увеличения расщепленной каспазы-3 соответственно. Обеспечение высокой чистоты бета-глюканов имеет важное значение для этого протокола. В этом протоколе используется передовое оборудование, такое как спектрофотометр, ВЭЖХ.
или FITR. Использование этих инструментов повышает надежность наших результатов. Мы можем уверенно проанализировать влияние бета-глюканов на микроглию и получить более уверенные результаты.
Из-за ограничений по времени и миру мы ограничили наш протокол изучением бета-глюканов на клетках микроглии. Тем не менее, другие клетки иммунной системы, такие как макрофаги или Т-клетки, могут быть легко доступны во время этого протокола. Впервые эти протоколы объединяют две разные области знаний.
Во-первых, использование биотехнологических процедур для очистки конкретных продуктов, а во-вторых, использование методов культивирования клеток для проверки их иммуномодулирующих свойств.
