בטא-גלוקנים פטרייתיים הם מודולטורים חשובים של מערכת החיסון. שיפור פרוטוקולי הטוהר והבידוד חיוני לקביעת תפקידם הפוטנציאלי כשותפים לטיפול בסרטן. רמה גבוהה של ארבעה בטא-גלוקנים שונים הושגה באמצעות התקנים שונים הנפוצים בביולוגיה מולקולרית ובמעבדות פרוטאומיות.
פרוטוקול זה מתמקד בבדיקת ההשפעות של בטא-גלוקנים על מיקרוגליה, תא החיסון הנפוץ ביותר במוח. אפנון הפנוטיפ של מיקרוגליה בגליובלסטומה יכול להניב תובנות חשובות לגבי. התחילו את המיצוי של פוליסכרידים פטרייתיים מסיסים או SMPs על ידי שטיפת גופי פרי טריים של Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ו-Ganoderma lucidum במים מזוקקים חמש פעמים.
לאחר מכן יבשו את גופי הפרי השטופים לחלוטין ב 50 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש אוויר רגיל במשך כ -24 שעות לפני טחינתם בטחנת להב קבלת כ -200 גרם אבקה מכל פטרייה. לאחר מכן, להשעות 100 גרם של כל ארבע אבקות פטריות או MP ב 1, 000 מיליליטר של מים מזוקקים autoclave את ההשעיה ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר 30 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את המתלה שנוצר ב 6, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן יבש את המשקע המכיל פוליסכרידים פטריות מסיסים או IMPs ב 50 מעלות צלזיוס בתנור ייבוש באוויר במשך 24 שעות. השליכו את המשקע ורכזו את הסופרנאטנט 10 פעמים במאייד סיבובי. לאחר מכן, זרזו את התרכיז המכיל SMPs עם אתנול למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר צנטריפוגה של תרחיף אתנול ב 6, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, להשליך את supernatant עם פיפטה ולשטוף את הגלולה שלוש פעמים עם 80% אתנול לפני המסתו ומים מזוקקים. כוונן את רמת החומציות ל-6.5 עד 7 ואת הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס והמיס את האלפא-גלוקנים על ידי טיפול בתרחיף עם שתי יחידות וארבע יחידות של אלפא-עמילאז וגלוקועמילאז בהתאמה. לאחר מכן, להתאים את ה- pH ל 8.0 ואת הטמפרטורה ל 50 מעלות צלזיוס ולהמיס את החלבונים על ידי טיפול בתרחיף עם אלקלאז שווה ערך ל 2.5 יחידות לגרם חלבון.
לאחר הידרוליזה, צנטריפוגו את ההידרוליזה ונקו את תרכיז הסופרנאטנט חמש פעמים במאייד סיבובי. זרזו שוב את תרכיז הסופרנאטנט על ידי הוספת 80% אתנול. כדי להסיר מולקולות בעלות משקל מולקולרי נמוך, להמיס את המשקע במים מזוקקים ולטשטש אותו במים המזוקקים למשך 24 שעות באמצעות 12, 000 ממברנות צינור תאית בחיתוך דלתון.
יש לשחזר את החלק המסיס במים ולייבש אותו בהקפאה כדי לייצר בטא-גלוקנים מסיסים או S בטא-Gs. הערך את סך כל הגלוקנים והאלפא-גלוקנים בנפרד. מדוד את ערכי בטא-גלוקן המתקבלים כהפרש בין ערכי הגלוקן הכולל לערכי אלפא-גלוקן.
כדי לקבל את ספקטרום UV S beta-G באמצעות ספקטרופוטומטר נראה UV, להכין 1.0 מיליגרם למיליליטר של כל S beta-G במים מזוקקים. מעבירים את הדגימה לקובט קוורץ וסורקים בטמפרטורת החדר באזור של 200 עד 400 ננומטר. הערך את ההומוגניות של S beta-Gs ואת המשקל המולקולרי של פולימרים לפי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל או SEC באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים או מערכת HPLC המצוידת בגלאי UV גלוי ועמודת סינון ג'ל Superdex TM 200 10/300 GL.
רשום את ספקטרום האינפרא אדום של הדגימה על ספקטרומטר אינפרא אדום או FTIR של התמרת פורייה בטווח של 4, 000 עד 500 לסנטימטר. הפעל את תאי מיקרוגליה על ידי ציפוי תאי מיקרוגליה BV2 למשך 72 שעות בריכוז של 0.2 מיליגרם למיליליטר של ארבעה בטא-גלוקנים שונים שבודדו מ- P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum ו- H.erinaceus. לאחר 72 שעות, לאסוף את supernatant עם פיפטה ולהעביר את הנפח הנותר דרך מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר.
לאחר מכן מקפיאים את הסופרנאטנט במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפחות. כדי לטפל ב-GL 261 עם התווך המותנה המופעל מראש של מיקרוגליה, יש להוסיף 250 מיקרוליטר של תאי מיקרוגליאה המטופלים בבטא-גלוקן ל-80% תאי GL 261 למשך 72 שעות. יש להשליך את המדיום לאחר 72 שעות.
ספקטרום UV של בטא-G S שונים לא הראה שיאי ספיגת UV ב 260 ו 280 ננומטר, מה שמצביע על כך S beta-Gs חסר חומצות גרעין וחלבונים. הכרומטוגרמות HPLC הראו הומוגניות טובה עם שיא חד ויחיד עיקרי של 10.9 דקות עבור P.ostreatus, 10.5 דקות עבור lucidum, 11.3 דקות עבור P.djamor, ו- 8.20 דקות עבור H.erinaceus, דבר המצביע על כך שהשבר עקבי עם הומופולימרים. ספקטרום FTIR מדד את התנודות המולקולריות המתאימות לקשרים רב-סוכריים קוולנטיים.
המחקר הראה כי SS beta-Gs מורכב מפחמימות מצומדות עם חלבון מינימלי. HPTLC ו-GC-MS שניתחו את הפרופיל החד-סוכרי של S beta-Gs חשפו נוכחות של כמות גדולה של D-גלוקוז, כמויות קטנות יותר של D-גלקטוז ו-D-מנוז, ועקבות של D-xylose, D-rhamnose, D-fucose ו-L-arabinose. באמצעות סקריפט פנימי בתוכנת ImageJ, כומתו מספר הפיקסלים החיוביים עבור כל ערוץ פלואורסצנטי.
הסקריפט השתמש בדגימות בקרה כסף לעוצמה של כל פלואורופור וסיפק את מספר הפיקסלים. הוא ציין את הביטוי עבור כל סמן לאחר תנאי ניסוי שונים. מעניין לציין כי GL 261 לא סבל מהבדלים משמעותיים לגבי התפשטות הגידול בחשיפה לאמצעי המיקרוגליה השונים.
עם זאת, P.djamor ו- H.erinaceus הראו אינדוקציה חזקה של עלייה של בערך פי שישה ותשעה בקספאז-3 שסוע בהתאמה. הבטחת טוהר ברמה גבוהה של בטא-גלוקנים חיונית לפרוטוקול זה. פרוטוקול זה משתמש בציוד מתקדם כגון ספקטרופוטומטר, HPLC.
או FITR. שימוש בכלים אלה משפר את איתנות הממצאים שלנו. אנו יכולים לנתח בביטחון את ההשפעות של בטא-גלוקנים על תאי מיקרוגליה ולקבל תוצאות בטוחות יותר.
בשל מגבלת הזמן והעולם, הגבלנו את הפרוטוקול שלנו לחקר בטא-גלוקנים על תאי מיקרוגליה. עם זאת, תאים אחרים ממערכת החיסון כגון מקרופאגים או תאי T יכולים להיות בקלות במהלך פרוטוקול זה. לראשונה, פרוטוקולים אלה משלבים שני תחומי ידע שונים.
ראשית, השימוש בהליך ביוטכנולוגי לטיהור מוצרים ספציפיים, ושנית, שימוש בטכניקות תרבית תאים כדי לבדוק את התכונות האימונומודולטוריות שלהם.
