Los betaglucanos fúngicos son moduladores importantes del sistema inmunológico. Mejorar la pureza y los protocolos de aislamiento es esencial para afirmar su papel potencial como coadyuvantes para la terapia del cáncer. Se logró un alto grado de cuatro beta-glucanos diferentes utilizando varios dispositivos que se encuentran comúnmente en biología molecular y laboratorios proteómicos.
Este protocolo se centra en probar los efectos de los beta-glucanos en la microglía, la célula inmune residente más abundante del cerebro. La modulación del fenotipo de microglía en el glioblastoma puede proporcionar información importante. Comience la extracción de polisacáridos solubles de hongos o SMP enjuagando los cuerpos fructíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus y Ganoderma lucidum con agua destilada cinco veces.
Luego seque completamente los cuerpos fructíferos lavados a 50 grados centígrados en un horno de secado al aire convencional durante aproximadamente 24 horas antes de molerlos en un molino de cuchillas obteniendo aproximadamente 200 gramos de polvo de cada hongo. A continuación, suspenda 100 gramos de los cuatro polvos de hongos o MP en 1, 000 mililitros de agua destilada y autoclave la suspensión a 121 grados centígrados durante 15 minutos. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugar la suspensión resultante a 6, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Luego seque el precipitado que contiene polisacáridos de hongos insolubles o IMP a 50 grados centígrados en un horno de secado al aire durante 24 horas. Deseche el precipitado y concentre el sobrenadante 10 veces en un evaporador rotativo. A continuación, precipite el concentrado que contiene SMP con etanol durante la noche a cuatro grados centígrados.
Después de centrifugar la suspensión de etanol a 6, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, deseche el sobrenadante con una pipeta y lave el pellet tres veces con etanol al 80% antes de disolverlo y destilar agua. Ajustar el pH a 6,5 a 7 y la temperatura a 37 grados centígrados y solubilizar los alfa-glucanos tratando la suspensión con dos unidades y cuatro unidades de alfa-amilasa y glucoamilasa respectivamente. A continuación, ajuste el pH a 8.0 y la temperatura a 50 grados centígrados y solubilice las proteínas tratando la suspensión con alcalasa equivalente a 2.5 unidades por gramo de proteína.
Después de la hidrólisis, centrifugar el hidrolizado y limpiar el concentrado sobrenadante cinco veces en un evaporador rotativo. Precipitar el concentrado sobrenadante de nuevo añadiendo 80% de etanol. Para eliminar moléculas de bajo peso molecular, solubilice el precipitado en agua destilada y dialícelo en el agua destilada durante 24 horas utilizando 12, 000 membranas de tubos de celulosa de corte Dalton.
Recupere la porción soluble en agua y liofilifíquela para producir beta-glucanos solubles o S beta-Gs. Evalúe los glucanos totales y los alfa-glucanos por separado. Mida los valores de beta-glucano resultantes como la diferencia entre los valores totales de glucano y alfa-glucano.
Para obtener los espectros UV S beta-G usando un espectrofotómetro UV visible, prepare 1.0 miligramo por mililitro de cada S beta-G en agua destilada. Transfiera la muestra a una cubeta de cuarzo y escanee a temperatura ambiente en la región de 200 a 400 nanómetros. Estimar la homogeneidad de S beta-Gs y el peso molecular de los polímeros por cromatografía de exclusión de tamaño o SEC utilizando un sistema de cromatografía líquida de alta resolución o HPLC equipado con un detector visible UV y una columna de filtración de gel Superdex TM 200 10/300 GL.
Registre los espectros infrarrojos de la muestra en un espectrómetro infrarrojo o FTIR por transformada de Fourier en el rango de 4.000 a 500 centímetros. Active la microglía recubriendo las células de microglía BV2 durante 72 horas con 0,2 miligramos por mililitro de concentración de cuatro betaglucanos diferentes aislados de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum y H. erinaceus. Después de 72 horas, recoja el sobrenadante con una pipeta y pase el volumen restante a través de un filtro de jeringa de 0,20 micrómetros.
Luego congele el sobrenadante a menos 80 grados centígrados durante al menos 24 horas. Para tratar GL 261 con el medio acondicionado de microglía preactivado, agregue 250 microlitros de medio microglial tratado con beta-glucano a 80% de células GL 261 confluentes durante 72 horas. Deseche el medio después de 72 horas.
Los espectros UV de los diferentes S beta-G no mostraron picos de absorción UV a 260 y 280 nanómetros, lo que indica que los S beta-G carecían de ácidos nucleicos y proteínas. Los cromatogramas HPLC mostraron una buena homogeneidad con un pico principal agudo y único a los 10,9 minutos para P.ostreatus, 10,5 minutos para lucidum, 11,3 minutos para P.djamor y 8,20 minutos para H.erinaceus, lo que sugiere que la fracción es consistente con los homopolímeros. Los espectros FTIR midieron las vibraciones moleculares correspondientes a los enlaces polisacáridos covalentes.
Mostró que SS beta-Gs comprendía carbohidratos conjugados con una proteína mínima. HPTLC y GC-MS analizando el perfil de monosacáridos de S beta-Gs revelaron la presencia de una gran cantidad de D-glucosa, cantidades más pequeñas de D-galactosa y D-manosa, y un rastro de D-xilosa, D-ramnosa, D-fucosa y L-arabinosa. Usando un script interno en el software ImageJ, se cuantificó el número de píxeles positivos para cada canal fluorescente.
El script utilizó muestras de control como umbral para la intensidad de cada fluoróforo y proporcionó el número de píxeles. Indicó la expresión para cada marcador después de diferentes condiciones experimentales. Curiosamente, GL 261 no sufrió diferencias significativas con respecto a la proliferación tumoral en la exposición a los diferentes medios condicionados por la microglía.
Sin embargo, P.djamor y H.erinaceus mostraron una fuerte inducción de un aumento de aproximadamente seis y nueve veces en la caspasa-3 escindida respectivamente. Garantizar una pureza de alto grado de beta-glucanos es esencial para este protocolo. Este protocolo utiliza equipos avanzados como espectrofotómetro, HPLC.
o FITR. El uso de estas herramientas mejora la solidez de nuestros hallazgos. Podemos analizar con confianza los efectos de los beta-glucanos en la microglía y obtener resultados más seguros.
Debido a la limitación de tiempo y mundo, hemos restringido nuestro protocolo al estudio de beta-glucanos en células microgliales. Sin embargo, otras células del sistema inmune, como los macrófagos o las células T, pueden ser fácilmente fáciles durante este protocolo. Por primera vez, estos protocolos combinan dos áreas de conocimiento diferentes.
En primer lugar, el uso de procedimientos biotecnológicos para purificar productos específicos, y en segundo lugar, el uso de técnicas de cultivo celular para probar sus propiedades inmunomoduladoras.
