Les bêta-glucanes fongiques sont d’importants modulateurs du système immunitaire. L’amélioration de la pureté et des protocoles d’isolement est essentielle pour affirmer leur rôle potentiel en tant que coadjuvants pour le traitement du cancer. Un degré élevé de quatre bêta-glucanes différents a été atteint en utilisant divers dispositifs couramment trouvés dans les laboratoires de biologie moléculaire et de protéomique.
Ce protocole vise à tester les effets des bêta-glucanes sur la microglie, la cellule immunitaire résidente la plus abondante du cerveau. La modulation du phénotype de la microglie dans le glioblastome peut fournir des informations importantes sur. Commencez l’extraction des polysaccharides solubles des champignons ou SMP en rinçant cinq fois les fructifications fraîches de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus et Ganoderma lucidum.
Ensuite, séchez complètement les fructifications lavées à 50 degrés Celsius dans un four de séchage à l’air conventionnel pendant environ 24 heures avant de les broyer dans un broyeur à lame en obtenant environ 200 grammes de poudre de chaque champignon. Ensuite, suspendez 100 grammes des quatre poudres de champignons ou MP dans 1 000 millilitres d’eau distillée et autoclavez la suspension à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 30 minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger la suspension obtenue à 6 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Séchez ensuite le précipité contenant des polysaccharides de champignons insolubles ou IMP à 50 degrés Celsius dans une étuve de séchage à l’air pendant 24 heures. Jeter le précipité et concentrer le surnageant 10 fois dans un évaporateur rotatif. Ensuite, précipiter le concentré contenant des SMP avec de l’éthanol pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Après avoir centrifugé la suspension d’éthanol à 6 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et laver la pastille trois fois avec de l’éthanol à 80 % avant de la dissoudre et de l’eau distillée. Ajustez le pH à 6,5 à 7 et la température à 37 degrés Celsius et solubilisez les alpha-glucanes en traitant la suspension avec deux unités et quatre unités d’alpha-amylase et de glucoamylase respectivement. Ensuite, ajustez le pH à 8,0 et la température à 50 degrés Celsius et solubilisez les protéines en traitant la suspension avec de l’alkalase équivalente à 2,5 unités par gramme de protéines.
Après hydrolyse, centrifuger l’hydrolysat et nettoyer le concentré surnageant cinq fois dans un évaporateur rotatif. Précipiter à nouveau le concentré surnageant en ajoutant 80% d’éthanol. Pour éliminer les molécules de faible poids moléculaire, solubiliser le précipité dans de l’eau distillée et le dialyser dans l’eau distillée pendant 24 heures à l’aide de 12 000 membranes de tubes de cellulose de coupure Dalton.
Récupérez la partie soluble dans l’eau et lyophilisez-la pour produire des bêta-glucanes solubles ou S bêta-G. Évaluez le nombre total de glucanes et d’alpha-glucanes séparément. Mesurez les valeurs de bêta-glucane résultantes comme la différence entre les valeurs de glucane total et d’alpha-glucane.
Pour obtenir les spectres UV S bêta-G à l’aide d’un spectrophotomètre UV visible, préparer 1,0 milligramme par millilitre de chaque S bêta-G dans de l’eau distillée. Transférer l’échantillon dans une cuvette de quartz et scanner à température ambiante dans la région de 200 à 400 nanomètres. Estimer l’homogénéité des S bêta-G et le poids moléculaire des polymères par chromatographie d’exclusion de taille ou SEC à l’aide d’un système de chromatographie liquide ou HPLC haute performance équipé d’un détecteur visible UV et d’une colonne de filtration sur gel Superdex TM 200 10/300 GL.
Enregistrer les spectres infrarouges de l’échantillon sur un spectromètre infrarouge à transformée de Fourier ou FTIR dans la plage de 4 000 à 500 centimètres. Activer la microglie en recouvrant les cellules microgliales BV2 pendant 72 heures avec une concentration de 0,2 milligramme par millilitre de quatre bêta-glucanes différents isolés de P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum et H. erinaceus. Après 72 heures, recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette et passer le volume restant à travers un filtre à seringue de 0,20 micromètre.
Ensuite, congelez le surnageant à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures. Pour traiter le GL 261 avec le milieu conditionné par la microglie préactivé, ajoutez 250 microlitres de milieu microglial traité au bêta-glucane à 80% de cellules GL 261 confluentes pendant 72 heures. Jeter le support après 72 heures.
Les spectres UV des différents S bêta-G n’ont pas montré de pics d’absorption UV à 260 et 280 nanomètres, ce qui indique que les S bêta-G manquaient d’acides nucléiques et de protéines. Les chromatogrammes CLHP ont montré une bonne homogénéité avec un pic principal aigu et unique à 10,9 minutes pour P. ostreatus, 10,5 minutes pour le lucidum, 11,3 minutes pour P. djamor et 8,20 minutes pour H. erinaceus, ce qui suggère que la fraction est compatible avec les homopolymères. Les spectres FTIR ont mesuré les vibrations moléculaires correspondant aux liaisons polysaccharidiques covalentes.
Il a montré que les bêta-G SS comprenaient des glucides conjugués à une protéine minimale. HPTLC et GC-MS analysant le profil monosaccharidique de S bêta-G ont révélé la présence d’une grande quantité de D-glucose, de plus petites quantités de D-galactose et de D-mannose, et une trace de D-xylose, D-rhamnose, D-fucose et L-arabinose. À l’aide d’un script interne dans le logiciel ImageJ, le nombre de pixels positifs pour chaque canal fluorescent a été quantifié.
Le script utilisait des échantillons de contrôle comme seuil pour l’intensité de chaque fluorophore et fournissait le nombre de pixels. Il indiquait l’expression de chaque marqueur après différentes conditions expérimentales. Fait intéressant, le GL 261 n’a pas subi de différences significatives en ce qui concerne la prolifération tumorale lors de l’exposition aux différents milieux conditionnés par la microglie.
Cependant, P. djamor et H. erinaceus ont montré une forte induction d’une augmentation d’environ six et neuf fois plus de caspase-3 clivée-3 respectivement. Assurer une pureté de haute qualité des bêta-glucanes est essentiel pour ce protocole. Ce protocole utilise des équipements avancés tels que spectrophotomètre, HPLC.
ou FITR. L’utilisation de ces outils améliore la robustesse de nos résultats. Nous pouvons analyser en toute confiance les effets des bêta-glucanes sur la microglie et obtenir des résultats plus fiables.
En raison du temps et des limites mondiales, nous avons limité notre protocole à l’étude des bêta-glucanes sur les cellules microgliales. Cependant, d’autres cellules du système immunitaire telles que les macrophages ou les cellules T peuvent être facilement pendant ce protocole. Pour la première fois, ces protocoles combinent deux domaines de connaissances différents.
Premièrement, l’utilisation de procédures biotechnologiques pour purifier des produits spécifiques et, deuxièmement, l’utilisation de techniques de culture cellulaire pour tester leurs propriétés immunomodulatrices.
