Os beta-glucanos fúngicos são importantes moduladores do sistema imunológico. Melhorar os protocolos de pureza e isolamento é essencial para afirmar seu papel potencial como coadjuvantes para a terapia do câncer. Um alto grau de quatro diferentes beta-glucanas foi obtido usando vários dispositivos comumente encontrados em laboratórios de biologia molecular e proteômica.
Este protocolo concentra-se em testar os efeitos dos beta-glucanos na microglia, a célula imunitária residente mais abundante do cérebro. A modulação do fenótipo da micróglia no glioblastoma pode produzir informações importantes sobre o assunto. Comece a extração de polissacarídeos solúveis de cogumelos ou SMPs enxaguando corpos frutíferos frescos de Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum com água destilada cinco vezes.
Em seguida, seque completamente os corpos frutíferos lavados a 50 graus Celsius em um forno de secagem convencional ao ar por aproximadamente 24 horas antes de moê-los em um moinho de lâminas obtendo cerca de 200 gramas de pó de cada cogumelo. Em seguida, suspenda 100 gramas de todos os quatro pós de cogumelos ou MP em 1.000 mililitros de água destilada e autoclave a suspensão a 121 graus Celsius por 15 minutos. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, centrifugar a suspensão resultante a 6.000 G durante 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, seque o precipitado contendo polissacarídeos insolúveis de cogumelos ou IMPs a 50 graus Celsius em um forno de secagem ao ar por 24 horas. Descarte o precipitado e concentre o sobrenadante 10 vezes em um evaporador rotativo. Em seguida, precipitar o concentrado contendo SMPs com etanol durante a noite a quatro graus Celsius.
Depois de centrifugar a suspensão de etanol a 6.000 G por 15 minutos a quatro graus Celsius, descartar o sobrenadante com uma pipeta e lavar o pellet três vezes com etanol 80% antes de dissolvê-lo e água destilada. Ajustar o pH para 6,5 a 7 e a temperatura para 37 graus Celsius e solubilizar os alfa-glucanos tratando a suspensão com duas unidades e quatro unidades de alfa-amilase e glucoamilase, respectivamente. Em seguida, ajuste o pH para 8,0 e a temperatura para 50 graus Celsius e solubilize as proteínas tratando a suspensão com alcalose equivalente a 2,5 unidades por grama de proteína.
Após a hidrólise, centrifugar o hidrolisado e limpar o concentrado sobrenadante cinco vezes em um evaporador rotativo. Precipitar novamente o concentrado sobrenadante adicionando 80% de etanol. Para remover moléculas de baixo peso molecular, solubilizar o precipitado em água destilada e dialisá-lo na água destilada por 24 horas usando 12.000 membranas de tubos de celulose de corte Dalton.
Recuperar a porção solúvel em água e secá-la por congelação para produzir beta-glucanas solúveis ou beta-Gs S. Avaliar separadamente as glucanas totais e as alfa-glucanas. Meça os valores de beta-glucana resultantes como a diferença entre os valores totais de glucano e alfa-glucano.
Para obter os espectros UV S beta-G usando um espectrofotômetro UV visível, prepare 1,0 miligrama por mililitro de cada S beta-G em água destilada. Transfira a amostra para uma cubeta de quartzo e digitalize à temperatura ambiente na região de 200 a 400 nanômetros. Estimar a homogeneidade de S beta-Gs e peso molecular de polímeros por cromatografia de exclusão de tamanho ou SEC usando uma cromatografia líquida de alta eficiência ou sistema HPLC equipado com um detector UV visível e uma coluna de filtração em gel Superdex TM 200 10/300 GL.
Registre os espectros infravermelhos da amostra em um espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier ou FTIR na faixa de 4.000 a 500 centímetros. Ativar a micróglia revestindo as células da micróglia BV2 por 72 horas com concentração de 0,2 miligramas por mililitro de quatro diferentes beta-glucanos isolados de P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum e H.erinaceus. Após 72 horas, coletar o sobrenadante com uma pipeta e passar o volume restante por um filtro de seringa de 0,20 micrômetro.
Em seguida, congele o sobrenadante a 80 graus Celsius negativos por pelo menos 24 horas. Para tratar o GL 261 com o meio pré-ativado condicionado por microglia, adicione 250 microlitros de meio microglial tratado com beta-glucano a 80% de células GL 261 confluentes por 72 horas. Descarte o meio após 72 horas.
Os espectros UV dos diferentes beta-Gs S não mostraram picos de absorção UV em 260 e 280 nanômetros, indicando que os beta-Gs S não possuíam ácidos nucléicos e proteínas. Os cromatogramas de HPLC mostraram boa homogeneidade com pico principal e único em 10,9 minutos para P.ostreatus, 10,5 minutos para lucidum, 11,3 minutos para P.djamor e 8,20 minutos para H.erinaceus, sugerindo que a fração é consistente com homopolímeros. Os espectros FTIR mediram as vibrações moleculares correspondentes às ligações polissacarídicas covalentes.
Mostrou que os beta-Gs da SS eram compostos por carboidratos conjugados com um mínimo de proteína. HPTLC e GC-MS analisando o perfil de monossacarídeos de S beta-Gs revelaram a presença de uma grande quantidade de D-glicose, menores quantidades de D-galactose e D-manose, e um traço de D-xilose, D-ramnose, D-fucose e L-arabinose. Usando um script interno no software ImageJ, o número de pixels positivos para cada canal fluorescente foi quantificado.
O script usou amostras de controle como um limiar para a intensidade de cada fluoróforo e forneceu o número de pixels. Indicou a expressão para cada marcador após diferentes condições experimentais. Curiosamente, o GL 261 não sofreu diferenças significativas quanto à proliferação tumoral na exposição aos diferentes meios condicionados pela micróglia.
Entretanto, P.djamor e H.erinaceus mostraram forte indução de um aumento de aproximadamente seis e nove vezes na caspase-3 clivada, respectivamente. Garantir uma pureza de alto grau de beta-glucanas é essencial para este protocolo. Este protocolo utiliza equipamentos avançados como espectrofotômetro, HPLC.
ou FITR. O uso dessas ferramentas aumenta a robustez de nossos achados. Podemos analisar com confiança os efeitos das beta-glucanas na micróglia e obter resultados mais confiáveis.
Devido à limitação temporal e mundial, restringimos nosso protocolo ao estudo de beta-glucanos em células microgliais. No entanto, outras células do sistema imunológico, como macrófagos ou células T, podem ser facilmente facilmente durante este protocolo. Pela primeira vez, esses protocolos combinam duas áreas diferentes do conhecimento.
Primeiro, o uso de procedimentos biotecnológicos para purificar produtos específicos e, segundo, o uso de técnicas de cultura celular para testar suas propriedades imunomoduladoras.
