بيتا جلوكان الفطرية هي معدلات مهمة للجهاز المناعي. يعد تعزيز بروتوكولات النقاء والعزل أمرا ضروريا لتأكيد دورهم المحتمل كمساعدين مشاركين لعلاج السرطان. تم تحقيق درجة عالية من أربعة بيتا جلوكان مختلفة باستخدام أجهزة مختلفة توجد عادة في البيولوجيا الجزيئية والمختبرات البروتينية.
يركز هذا البروتوكول على اختبار آثار بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلية المناعية المقيمة الأكثر وفرة في الدماغ. يمكن أن يؤدي تعديل النمط الظاهري للخلايا الدبقية الصغيرة في الورم الأرومي الدبقي إلى رؤى مهمة في. ابدأ في استخراج السكريات الفطرية القابلة للذوبان أو SMPs عن طريق شطف الأجسام المثمرة الطازجة من Pleurotus ostreatus و Pleurotus djamor و Hericium erinaceus و Ganoderma lucidum بالماء المقطر خمس مرات.
ثم جفف أجسام الثمار المغسولة تماما عند 50 درجة مئوية في فرن تجفيف الهواء التقليدي لمدة 24 ساعة تقريبا قبل طحنها في مطحنة شفرة للحصول على حوالي 200 جرام من المسحوق من كل فطر. بعد ذلك ، قم بتعليق 100 جرام من مساحيق الفطر الأربعة أو MP في 1،000 ملليلتر من الماء المقطر والأوتوكلاف التعليق عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. بعد 30 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، قم بطرد مركزي التعليق الناتج عند 6،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم جفف الراسب الذي يحتوي على السكريات الفطرية غير القابلة للذوبان أو IMPs عند 50 درجة مئوية في فرن تجفيف الهواء لمدة 24 ساعة. تخلص من الراسب وركز المادة الطافية 10 مرات في مبخر دوار. بعد ذلك ، قم بترسيب التركيز الذي يحتوي على SMPs مع الإيثانول طوال الليل عند أربع درجات سلزية.
بعد الطرد المركزي لتعليق الإيثانول عند 6،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة واغسل الحبيبات ثلاث مرات بإيثانول 80٪ قبل إذابتها والماء المقطر. اضبط الرقم الهيدروجيني على 6.5 إلى 7 ودرجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وقم بإذابة ألفا جلوكان عن طريق معالجة المعلق بوحدتين وأربع وحدات من ألفا الأميليز والجلوكواميلاز على التوالي. بعد ذلك ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 ودرجة الحرارة على 50 درجة مئوية وقم بإذابة البروتينات عن طريق معالجة المعلق بالقلويز بما يعادل 2.5 وحدة لكل جرام من البروتين.
بعد التحلل المائي ، يقوم جهاز الطرد المركزي بالتحلل المائي وتنظيف تركيز المادة الطافية خمس مرات في مبخر دوار. ترسيب تركيز الطافات مرة أخرى بإضافة 80٪ إيثانول. لإزالة جزيئات الوزن الجزيئي المنخفض ، قم بإذابة الراسب في الماء المقطر وتقطيعه في الماء المقطر لمدة 24 ساعة باستخدام 12،000 أغشية أنابيب السليلوز المقطوعة من دالتون.
استرجع الجزء القابل للذوبان في الماء وقم بتجميده وجففه لإنتاج بيتا جلوكان قابل للذوبان أو S beta-Gs. تقييم إجمالي الجلوكان وألفا جلوكان بشكل منفصل. قم بقياس قيم بيتا جلوكان الناتجة كفرق بين إجمالي قيم الجلوكان وألفا جلوكان.
للحصول على أطياف الأشعة فوق البنفسجية S beta-G باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية ، قم بإعداد 1.0 ملليغرام لكل ملليلتر من كل S beta-G في الماء المقطر. انقل العينة إلى كفيت كوارتز وامسحها ضوئيا في درجة حرارة الغرفة في منطقة 200 إلى 400 نانومتر. تقدير تجانس S beta-Gs والوزن الجزيئي للبوليمرات عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم أو SEC باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء أو نظام HPLC مزود بكاشف مرئي للأشعة فوق البنفسجية وعمود ترشيح جل Superdex TM 200 10/300 GL.
سجل أطياف الأشعة تحت الحمراء للعينة على مطياف الأشعة تحت الحمراء لتحويل فورييه أو FTIR في نطاق 4،000 إلى 500 في المائة. قم بتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق طلاء خلايا الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 لمدة 72 ساعة بتركيز 0.2 ملليغرام لكل ملليلتر من أربعة بيتا جلوكان مختلفة معزولة من P.ostreatus و P.djamor و G.lucidum و H.erinaceus. بعد 72 ساعة ، اجمع المادة الطافية باستخدام ماصة وقم بتمرير الحجم المتبقي من خلال مرشح حقنة 0.20 ميكرومتر.
ثم قم بتجميد المادة الطافية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 24 ساعة على الأقل. لعلاج GL 261 باستخدام الوسط المكيف للخلايا الدبقية الصغيرة المنشط مسبقا ، أضف 250 ميكرولترا من الوسط الدبقي الصغير المعالج بالبيتا جلوكان إلى 80٪ من خلايا GL 261 المتقاربة لمدة 72 ساعة. تخلص من الوسيلة بعد 72 ساعة.
لم تظهر أطياف الأشعة فوق البنفسجية لمختلف S beta-Gs قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 260 و 280 نانومتر ، مما يشير إلى أن S beta-Gs تفتقر إلى الأحماض النووية والبروتينات. أظهرت كروماتوجرام HPLC تجانسا جيدا مع ذروة رئيسية حادة ومفردة في 10.9 دقيقة ل P.ostreatus ، و 10.5 دقيقة للوسيدوم ، و 11.3 دقيقة ل P.djamor ، و 8.20 دقيقة ل H.erinaceus ، مما يشير إلى أن الكسر يتوافق مع البوليمرات المتجانسة. قامت أطياف FTIR بقياس الاهتزازات الجزيئية المقابلة لروابط السكاريد التساهمية.
وأظهرت أن SS beta-Gs يتكون من الكربوهيدرات المترافقة مع الحد الأدنى من البروتين. كشف تحليل HPTLC و GC-MS لملف تعريف السكاريد الأحادي ل S beta-Gs عن وجود كمية كبيرة من D-glucose ، وكميات أصغر من D-galactose و D-mannose ، وأثر D-xylose و D-rhamnose و D-fucose و L-arabinose. باستخدام برنامج نصي داخلي في برنامج ImageJ ، تم تحديد عدد وحدات البكسل الموجبة لكل قناة فلورسنت.
استخدم البرنامج النصي عينات التحكم كعتبة لشدة كل فلوروفور وقدم عدد البكسلات. وأشار إلى التعبير لكل علامة بعد ظروف تجريبية مختلفة. ومن المثير للاهتمام أن GL 261 لم يعاني من اختلافات كبيرة فيما يتعلق بانتشار الورم عند التعرض لمختلف الوسائط المشروطة بالخلايا الدبقية الصغيرة.
ومع ذلك ، أظهر P.djamor و H.erinaceus تحريضا قويا لزيادة ستة أضعاف وتسعة أضعاف تقريبا في caspase-3 المشقوق على التوالي. يعد ضمان نقاء عالي الجودة من بيتا جلوكان أمرا ضروريا لهذا البروتوكول. يستخدم هذا البروتوكول معدات متطورة مثل مقياس الطيف الضوئي ، HPLC.
أو فيتر. استخدام هذه الأدوات يعزز قوة النتائج التي توصلنا إليها. يمكننا بثقة تحليل آثار بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة والحصول على نتائج أكثر ثقة.
نظرا لضيق الوقت والعالم ، قمنا بتقييد بروتوكولنا لدراسة بيتا جلوكان على الخلايا الدبقية الصغيرة. ومع ذلك ، يمكن بسهولة استخدام خلايا أخرى من الجهاز المناعي مثل البلاعم أو الخلايا التائية بسهولة خلال هذا البروتوكول. لأول مرة ، تجمع هذه البروتوكولات بين مجالين مختلفين من المعرفة.
أولا ، استخدام إجراءات التكنولوجيا الحيوية لتنقية منتجات معينة ، وثانيا ، استخدام تقنيات زراعة الخلايا لاختبار خصائصها المناعية.
