I beta-glucani fungini sono importanti modulatori del sistema immunitario. Migliorare i protocolli di purezza e isolamento è essenziale per affermare il loro potenziale ruolo come coadiuvanti per la terapia del cancro. Un alto grado di quattro diversi beta-glucani è stato raggiunto utilizzando vari dispositivi comunemente presenti nei laboratori di biologia molecolare e proteomica.
Questo protocollo si concentra sul test degli effetti dei beta-glucani sulla microglia, la cellula immunitaria residente più abbondante del cervello. La modulazione del fenotipo della microglia nel glioblastoma può fornire importanti informazioni su. Iniziare l'estrazione di polisaccaridi solubili di funghi o SMP risciacquando corpi fruttiferi freschi di Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus e Ganoderma lucidum con acqua distillata cinque volte.
Quindi asciugare completamente i corpi fruttiferi lavati a 50 gradi Celsius in un forno di essiccazione ad aria convenzionale per circa 24 ore prima di macinarli in un mulino a lama ottenendo circa 200 grammi di polvere da ciascun fungo. Quindi, sospendere 100 grammi di tutte e quattro le polveri di funghi o MP in 1.000 millilitri di acqua distillata e autoclavare la sospensione a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione a temperatura ambiente, centrifugare la sospensione risultante a 6.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi asciugare il precipitato contenente polisaccaridi di funghi insolubili o IMP a 50 gradi Celsius in un forno ad aria di essiccazione per 24 ore. Scartare il precipitato e concentrare il surnatante 10 volte in un evaporatore rotante. Quindi, precipitare il concentrato contenente SMP con etanolo durante la notte a quattro gradi Celsius.
Dopo aver centrifugato la sospensione di etanolo a 6.000 G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il surnatante con una pipetta e lavare il pellet tre volte con etanolo all'80% prima di scioglierlo e acqua distillata. Regolare il pH a 6,5-7 e la temperatura a 37 gradi Celsius e solubilizzare gli alfa-glucani trattando la sospensione con due unità e quattro unità di alfa-amilasi e glucoamilasi rispettivamente. Quindi, regolare il pH a 8,0 e la temperatura a 50 gradi Celsius e solubilizzare le proteine trattando la sospensione con alcalasi equivalente a 2,5 unità per grammo di proteine.
Dopo l'idrolisi, centrifugare l'idrolizzato e pulire il concentrato di surnatante cinque volte in un evaporatore rotante. Precipitare nuovamente il concentrato di surnatante aggiungendo l'80% di etanolo. Per rimuovere le molecole a basso peso molecolare, solubilizzare il precipitato in acqua distillata e dializzarlo nell'acqua distillata per 24 ore utilizzando 12.000 membrane di tubi di cellulosa Dalton.
Recuperare la parte solubile in acqua e liofilizzarla per produrre beta-glucani solubili o S beta-G. Valutare separatamente i glucani totali e gli alfa-glucani. Misurare i valori di beta-glucano risultanti come differenza tra i valori totali di glucano e alfa-glucano.
Per ottenere gli spettri UV S beta-G utilizzando uno spettrofotometro UV visibile, preparare 1,0 milligrammi per millilitro di ogni S beta-G in acqua distillata. Trasferire il campione in una cuvetta di quarzo e scansionarlo a temperatura ambiente nella regione da 200 a 400 nanometri. Stimare l'omogeneità di S beta-G e il peso molecolare dei polimeri mediante cromatografia ad esclusione dimensionale o SEC utilizzando una cromatografia liquida ad alte prestazioni o un sistema HPLC dotato di un rivelatore UV visibile e di una colonna di filtrazione in gel Superdex TM 200 10/300 GL.
Registrare gli spettri infrarossi del campione su uno spettrometro a infrarossi o FTIR a trasformata di Fourier nell'intervallo da 4.000 a 500 per centimetro. Attivare la microglia rivestendo le cellule della microglia BV2 per 72 ore con una concentrazione di 0,2 milligrammi per millilitro di quattro diversi beta-glucani isolati da P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum e H.erinaceus. Dopo 72 ore, raccogliere il surnatante con una pipetta e passare il volume rimanente attraverso un filtro a siringa da 0,20 micrometri.
Quindi congelare il surnatante a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Per trattare GL 261 con il mezzo pre-attivato condizionato dalla microglia, aggiungere 250 microlitri di terreno microgliale trattato con beta-glucano all'80% di cellule GL 261 confluenti per 72 ore. Scartare il mezzo dopo 72 ore.
Gli spettri UV dei diversi S beta-G non hanno mostrato picchi di assorbimento UV a 260 e 280 nanometri, indicando che gli S beta-G mancavano di acidi nucleici e proteine. I cromatogrammi HPLC hanno mostrato una buona omogeneità con un picco principale acuto e singolo a 10,9 minuti per P.ostreatus, 10,5 minuti per lucidum, 11,3 minuti per P.djamor e 8,20 minuti per H.erinaceus, suggerendo che la frazione è coerente con gli omopolimeri. Gli spettri FTIR hanno misurato le vibrazioni molecolari corrispondenti ai legami polisaccaridici covalenti.
Ha dimostrato che i beta-G SS comprendevano carboidrati coniugati con una proteina minima. HPTLC e GC-MS analizzando il profilo monosaccaridico di S beta-G hanno rivelato la presenza di una grande quantità di D-glucosio, piccole quantità di D-galattosio e D-mannosio e una traccia di D-xilosio, D-ramnosio, D-fucosio e L-arabinosio. Utilizzando uno script interno nel software ImageJ, è stato quantificato il numero di pixel positivi per ciascun canale fluorescente.
Lo script utilizzava campioni di controllo come soglia per l'intensità di ciascun fluoroforo e forniva il numero di pixel. Ha indicato l'espressione per ciascun marcatore dopo diverse condizioni sperimentali. È interessante notare che GL 261 non ha subito differenze significative per quanto riguarda la proliferazione tumorale sull'esposizione ai diversi mezzi condizionati dalla microglia.
Tuttavia, P.djamor e H.erinaceus hanno mostrato una forte induzione di un aumento di circa sei e nove volte rispettivamente della caspasi-3 scissa. Garantire una purezza di alta qualità dei beta-glucani è essenziale per questo protocollo. Questo protocollo utilizza apparecchiature avanzate come spettrofotometro, HPLC.
o FITR. L'utilizzo di questi strumenti migliora la robustezza dei nostri risultati. Possiamo analizzare con sicurezza gli effetti dei beta-glucani sulla microglia e ottenere risultati più sicuri.
A causa del tempo e dei limiti mondiali, abbiamo limitato il nostro protocollo allo studio dei beta-glucani sulle cellule microgliali. Tuttavia, altre cellule del sistema immunitario come macrofagi o cellule T possono essere facilmente durante questo protocollo. Per la prima volta, questi protocolli combinano due diverse aree di conoscenza.
In primo luogo, l'uso di procedure biotecnologiche per purificare prodotti specifici e, in secondo luogo, l'uso di tecniche di coltura cellulare per testare le loro proprietà immunomodulatorie.
