Fungal beta-glukanlar bağışıklık sisteminin önemli modülatörleridir. Saflık ve izolasyon protokollerinin arttırılması, kanser tedavisi için ortak adjuvan olarak potansiyel rollerini ortaya koymak için gereklidir. Moleküler biyoloji ve proteomik laboratuvarlarda yaygın olarak bulunan çeşitli cihazlar kullanılarak dört farklı beta-glukandan oluşan yüksek bir dereceye ulaşıldı.
Bu protokol, beta-glukanların beynin en bol bulunan yerleşik bağışıklık hücresi olan mikroglia üzerindeki etkilerini test etmeye odaklanmaktadır. Glioblastomada mikroglia fenotipini modüle etmek, önemli bilgiler sağlayabilir. Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum'un taze meyve veren gövdelerini damıtılmış suyla beş kez durulayarak çözünür mantar polisakkaritlerinin veya SMP'lerin ekstraksiyonuna başlayın.
Daha sonra, yıkanmış meyve veren gövdeleri, her mantardan yaklaşık 200 gram toz elde eden bir bıçak değirmeninde öğütmeden önce yaklaşık 24 saat boyunca geleneksel bir hava kurutma fırınında 50 santigrat derecede tamamen kurutun. Daha sonra, dört mantar tozunun veya MP'nin 100 gramını 1.000 mililitre damıtılmış suda askıya alın ve süspansiyonu 15 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklavlayın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık inkübasyondan sonra, elde edilen süspansiyonu dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin.
Daha sonra çözünmeyen mantar polisakkaritleri veya IMP'leri içeren çökeltiyi 50 santigrat derecede 24 saat boyunca hava kurutma fırınında kurutun. Çökeltiyi atın ve süpernatantı döner bir evaporatörde 10 kez konsantre edin. Daha sonra, SMP'leri içeren konsantreyi gece boyunca dört santigrat derecede etanol ile çökeltin.
Etanol süspansiyonunu 6.000 G'de dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, süpernatantı bir pipetle atın ve peleti çözmeden ve damıtılmış suyla çözmeden önce% 80 etanol ile üç kez yıkayın. PH'ı 6.5 ila 7'ye ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın ve süspansiyonu sırasıyla iki birim ve dört birim alfa-amilaz ve glukoamilaz ile muamele ederek alfa-glukanları çözündürün. Daha sonra, pH'ı 8.0'a ve sıcaklığı 50 santigrat dereceye ayarlayın ve süspansiyonu gram protein başına 2.5 birime eşdeğer alkalaz ile muamele ederek proteinleri çözünürleştirin.
Hidrolizden sonra, hidrolizatı santrifüj edin ve süpernatant konsantresini döner bir evaporatörde beş kez temizleyin. %80 etanol ekleyerek süpernatant konsantresini tekrar çökeltin. Düşük molekül ağırlıklı molekülleri uzaklaştırmak için, çökeltiyi damıtılmış suda çözündürün ve 12.000 Dalton kesme selüloz boru membranı kullanarak 24 saat boyunca damıtılmış suda diyaliz edin.
Suda çözünür kısmı geri kazanın ve çözünür beta-glukanlar veya S beta-Gs üretmek için dondurarak kurutun. Toplam glukanları ve alfa-glukanları ayrı ayrı değerlendirin. Elde edilen beta-glukan değerlerini, toplam glukan ve alfa-glukan değerleri arasındaki fark olarak ölçün.
Bir UV görünür spektrofotometre kullanarak S beta-G UV spektrumlarını elde etmek için, damıtılmış suda her bir S beta-G'nin mililitresi başına 1.0 miligram hazırlayın. Numuneyi bir kuvars küvete aktarın ve 200 ila 400 nanometre bölgesinde oda sıcaklığında tarayın. UV görünür dedektörü ve Superdex TM 200 10/300 GL jel filtrasyon sütunu ile donatılmış yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi veya HPLC sistemi kullanarak S beta-G'lerin homojenliğini ve polimerlerin moleküler ağırlığını boyut dışlama kromatografisi veya SEC ile tahmin edin.
Numunenin kızılötesi spektrumlarını, santimetre başına 4.000 ila 500 aralığında bir Fourier dönüşümlü kızılötesi veya FTIR spektrometresine kaydedin. BV2 mikroglia hücrelerini 72 saat boyunca P.ostreatus, P.djamor, G.lucidum ve H.erinaceus'tan izole edilen dört farklı beta-glukan konsantrasyonu mililitre konsantrasyonu başına 0.2 miligram ile kaplayarak mikrogliayı aktive edin. 72 saat sonra, süpernatantı bir pipetle toplayın ve kalan hacmi 0.20 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin.
Daha sonra süpernatantı eksi 80 santigrat derecede en az 24 saat dondurun. GL 261'i önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış ortam ile tedavi etmek için, 72 saat boyunca% 80 confluent GL 261 hücrelerine 250 mikrolitre beta-glukan ile muamele edilmiş mikroglial ortam ekleyin. Ortamı 72 saat sonra atın.
Farklı S beta-G'lerin UV spektrumları, 260 ve 280 nanometrelerde UV absorpsiyon zirveleri göstermedi, bu da S beta-Gs'nin nükleik asitlerden ve proteinlerden yoksun olduğunu gösterdi. HPLC kromatogramları, P.ostreatus için 10.9 dakika, lucidum için 10.5 dakika, P.djamor için 11.3 dakika ve H.erinaceus için 8.20 dakika olmak üzere ana keskin ve tek bir tepe noktası ile iyi bir homojenlik gösterdi ve bu da fraksiyonun homopolimerlerle tutarlı olduğunu düşündürdü. FTIR spektrumları, kovalent polisakkarit bağlarına karşılık gelen moleküler titreşimleri ölçtü.
SS beta-Gs'nin minimal bir protein ile konjuge edilmiş karbonhidratlardan oluştuğunu gösterdi. S beta-Gs'nin monosakkarit profilini analiz eden HPTLC ve GC-MS, BÜYÜK MIKTARDA D-glikoz, daha az miktarda D-galaktoz ve D-mannoz ve D-ksiloz, D-ramnoz, D-fukoz ve L-arabinoz izlerinin varlığını ortaya koydu. ImageJ yazılımında şirket içi bir komut dosyası kullanılarak, her floresan kanal için pozitif piksel sayısı ölçüldü.
Komut dosyası, kontrol örneklerini her floroforun yoğunluğu için bir eşik olarak kullandı ve piksel sayısını sağladı. Farklı deneysel koşullardan sonra her bir belirteç için ifadeyi gösterdi. İlginçtir ki, GL 261, farklı mikroglia şartlandırılmış ortamlara maruz kalmada tümör proliferasyonu ile ilgili önemli farklılıklar yaşamamıştır.
Bununla birlikte, P.djamor ve H.erinaceus, yarıklı kaspaz-3'te sırasıyla yaklaşık altı kat ve dokuz kat artışın güçlü bir indüksiyonunu göstermiştir. Beta-glukanların yüksek dereceli saflığının sağlanması bu protokol için esastır. Bu protokol spektrofotometre, HPLC gibi gelişmiş ekipmanları kullanır.
veya FITR. Bu araçları kullanmak, bulgularımızın sağlamlığını artırır. Beta-glukanların mikroglia üzerindeki etkilerini güvenle analiz edebilir ve daha güvenli sonuçlar elde edebiliriz.
Zaman ve dünya sınırlaması nedeniyle, protokolümüzü mikroglial hücreler üzerindeki beta-glukanların incelenmesiyle sınırlandırdık. Bununla birlikte, makrofajlar veya T hücreleri gibi bağışıklık sisteminden diğer hücreler bu protokol sırasında kolayca olabilir. İlk kez, bu protokoller iki farklı bilgi alanını birleştiriyor.
Birincisi, belirli ürünleri saflaştırmak için biyoteknolojik prosedürün kullanılması ve ikincisi, immünomodülatör özelliklerini test etmek için hücre kültürü tekniklerinin kullanılması.
