Beta-Glucane von Pilzen sind wichtige Modulatoren des Immunsystems. Die Verbesserung der Reinheits- und Isolationsprotokolle ist unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Co-Adjuvantien für die Krebstherapie zu behaupten. Ein hoher Gehalt an vier verschiedenen Beta-Glucanen wurde mit verschiedenen Geräten erreicht, die üblicherweise in molekularbiologischen und proteomischen Labors zu finden sind.
Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Prüfung der Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia, die am häufigsten vorkommende Immunzelle des Gehirns. Die Modulation des Mikroglia-Phänotyps im Glioblastom kann wichtige Erkenntnisse liefern. Beginnen Sie mit der Extraktion von löslichen Pilzpolysacchariden oder SMPs, indem Sie frische Fruchtkörper von Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum fünfmal mit destilliertem Wasser abspülen.
Trocknen Sie dann die gewaschenen Fruchtkörper etwa 24 Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem herkömmlichen Lufttrockner vollständig ab, bevor Sie sie in einer Messermühle mahlen, um von jedem Pilz etwa 200 Gramm Pulver zu erhalten. Als nächstes suspendieren Sie 100 Gramm aller vier Pilzpulver oder MP in 1.000 Milliliter destilliertem Wasser und autoklavieren die Suspension bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wird die entstandene Suspension bei 6.000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert.
Anschließend trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden oder IMPs bei 50 Grad Celsius für 24 Stunden an der Luft. Verwerfen Sie den Niederschlag und konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer. Als nächstes wird das SMP-haltige Konzentrat über Nacht bei vier Grad Celsius mit Ethanol ausgefällt.
Nachdem Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 G 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert haben, entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette und waschen Sie das Pellet dreimal mit 80%igem Ethanol, bevor Sie es und destilliertes Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 bis 7 und die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein und lösen Sie die Alpha-Glucane, indem Sie die Suspension mit zwei Einheiten bzw. vier Einheiten Alpha-Amylase bzw. Glucoamylase behandeln. Als nächstes stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 und die Temperatur auf 50 Grad Celsius ein und lösen die Proteine, indem Sie die Suspension mit Alkalase behandeln, die 2,5 Einheiten pro Gramm Protein entspricht.
Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat zentrifugiert und das überstehende Konzentrat fünfmal in einem Rotationsverdampfer gereinigt. Das überstehende Konzentrat durch Zugabe von 80%igem Ethanol erneut ausfällen. Um niedermolekulare Moleküle zu entfernen, lösen Sie den Niederschlag in destilliertem Wasser und dialysieren Sie ihn 24 Stunden lang im destillierten Wasser mit 12.000 Dalton-Cutoff-Zelluloseschlauchmembranen.
Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche Beta-Glucane oder S beta-Gs herzustellen. Bewerten Sie die Gesamtglucane und Alpha-Glucane separat. Messen Sie die resultierenden Beta-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und Alpha-Glucan-Werten.
Um die S beta-G UV-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer zu erhalten, bereiten Sie 1,0 Milligramm pro Milliliter jedes S beta-G in destilliertem Wasser vor. Übertragen Sie die Probe in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur im Bereich von 200 bis 400 Nanometern. Schätzen Sie die Homogenität von S beta-Gs und das Molekulargewicht von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie oder SEC unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- oder HPLC-Systems, das mit einem UV-sichtbaren Detektor und einer Superdex TM 200 10/300 GL Gelfiltrationssäule ausgestattet ist.
Zeichnen Sie die Infrarotspektren der Probe mit einem Infrarot- oder FTIR-Spektrometer mit Fourier-Transformation im Bereich von 4.000 bis 500 Prozent auf. Aktivieren Sie die Mikroglia, indem Sie die BV2-Mikrogliazellen 72 Stunden lang mit einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter von vier verschiedenen Beta-Glucanen beschichten, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus isoliert wurden. Nach 72 Stunden wird der Überstand mit einer Pipette aufgefangen und das verbleibende Volumen durch einen 0,20-Mikrometer-Spritzenfilter geleitet.
Anschließend frieren Sie den Überstand bei minus 80 Grad Celsius für mindestens 24 Stunden ein. Um GL 261 mit dem voraktivierten mikrogliakonditionierten Medium zu behandeln, werden 250 Mikroliter mit Beta-Glucan behandeltes Mikrogliamedium für 72 Stunden zu 80 % konfluierenden GL 261-Zellen hinzugefügt. Entsorgen Sie das Medium nach 72 Stunden.
Die UV-Spektren der verschiedenen S-beta-Gs zeigten keine UV-Absorptionsspitzen bei 260 und 280 Nanometern, was darauf hindeutet, dass S-beta-Gs Nukleinsäuren und Proteine fehlten. Die HPLC-Chromatogramme zeigten eine gute Homogenität mit einem scharfen und einzelnen Hauptpeak bei 10,9 Minuten für P. ostreatus, 10,5 Minuten für Lucidum, 11,3 Minuten für P. djamor und 8,20 Minuten für H. erinaceus, was darauf hindeutet, dass die Fraktion mit Homopolymeren übereinstimmt. Die FTIR-Spektren maßen die molekularen Schwingungen, die kovalenten Polysaccharidbindungen entsprechen.
Es zeigte sich, dass SS beta-Gs aus Kohlenhydraten bestand, die mit einem minimalen Protein konjugiert waren. HPTLC und GC-MS, die das Monosaccharidprofil von S beta-Gs analysierten, zeigten das Vorhandensein einer großen Menge an D-Glucose, kleineren Mengen an D-Galactose und D-Mannose sowie einer Spur von D-Xylose, D-Rhamnose, D-Fucose und L-Arabinose. Mit Hilfe eines hauseigenen Skripts in der ImageJ-Software wurde die Anzahl der positiven Pixel für jeden Fluoreszenzkanal quantifiziert.
Das Skript verwendete Kontrollproben als Schwellenwert für die Intensität jedes Fluorophors und gab die Anzahl der Pixel an. Es gab die Expression für jeden Marker nach verschiedenen experimentellen Bedingungen an. Interessanterweise zeigte GL 261 keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf die Tumorproliferation unter Exposition bei den verschiedenen Mikroglia-konditionierten Medien.
P. djamor und H. erinaceus zeigten jedoch eine starke Induktion eines etwa sechsfachen bzw. neunfachen Anstiegs der gespaltenen Caspase-3. Die Gewährleistung einer hochgradigen Reinheit der Beta-Glucane ist für dieses Protokoll von entscheidender Bedeutung. Dieses Protokoll verwendet fortschrittliche Geräte wie Spektralphotometer und HPLC.
oder FITR. Die Verwendung dieser Tools erhöht die Robustheit unserer Ergebnisse. Wir können die Wirkung von Beta-Glucanen auf Mikroglia sicher analysieren und zuverlässigere Ergebnisse erzielen.
Aus zeitlichen und weltweiten Gründen haben wir unser Protokoll auf die Untersuchung von Beta-Glucanen auf Mikrogliazellen beschränkt. Andere Zellen des Immunsystems wie Makrophagen oder T-Zellen können jedoch problemlos während dieses Protokolls sein. Zum ersten Mal kombinieren diese Protokolle zwei unterschiedliche Wissensgebiete.
Zum einen der Einsatz biotechnologischer Verfahren zur Reinigung bestimmter Produkte und zum anderen der Einsatz von Zellkulturtechniken zur Prüfung ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften.
