반전 콜로이드 결정체 폴리 (에틸렌 글리콜) 비계의 제작 : 간 조직 공학을위한 삼차원 세포 배양 플랫폼

요약

This manuscript presents a detailed protocol for the fabrication of an emerging three-dimensional hepatocyte culture platform, the inverted colloidal crystal scaffold, and the concomitant techniques to assess hepatocyte behavior. The size-controllable pores, interconnectivity and ability to conjugate extracellular matrix proteins to the poly(ethylene glycol) (PEG) scaffold enhance Huh-7.5 cell performance.

초록

, 생체 이물질 '독성 테스트 바이러스 감염 연구 및 간암을 대상으로 약물을 개발하기위한 목적으로, 시험 관내 간세포의 기능을 유지하는 능력은 세포 적당한 생화학 적 및 기계적 신호를 수신 한 플랫폼이 필요하다. 최근 간 조직 공학 시스템은 높은 수분 보유하고 세포에 필요한 기계적인 자극을 제공 할 능력이 주어 합성 또는 천연 하이드로 겔로 구성된 3 차원 지지체를 이용 하였다. 반전 콜로이드 결정 (ICC) 지지체에 대한 관심이 증가되고있다, 높은 공간 조직 동형과 이형 세포의 상호 작용뿐만 아니라, 세포 외 기질 (ECM)의 상호 작용을 가능하게하는 최근에 개발. 여기서, 우리는 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA) 및 입자 침출 방법을 이용하여 ICC 지지체를 제조하는 프로토콜을 기술한다. 간략하게, 격자는 미세 입자로부터 만들어지는 전 후 polymeR 용액 중합 적절히 첨가되고, 입자는 유기 용매 (예 : 테트라 히드로 푸란)을 사용하여 제거하거나 침출된다. 제어 된 기공 크기 및 미디어보다 쉽게​​ 세포에 도달 할 수 있도록 상호 연관성이있는 다공성 지지체의 격자 결과의 용해. 이 독특한 구조는 세포뿐만 아니라 쉽게 기공 사이의 통신, 및 단백질과 PEGDA의 ICC 지지체는 전지 성능에 현저한 효과를 나타낸다 코팅 할 수있는 능력에 부착하기위한 고 표면적을 허용한다. 우리는 가능성의 관점에서, 골격의 형태뿐만 아니라, 간암 세포 (허 7.5) 동작을 분석하고 ICC 구조 ECM 코팅의 효과를 조사하는 기능을한다. 전반적으로,이 논문은 조직 공학에서 다양한 응용 프로그램, 특히 간 조직 공학을 가진 새로운 발판의 상세한 프로토콜을 제공합니다.

서문

간은 혈액 해독, 생체 이물질의 대사 및 혈청 단백질의 생산을 포함하여 다양한 기능을 가진 매우 혈관 기관이다. 간 조직은 여러 종류의 세포, 담즙 누소관, 정현파 및 다른 biomatrix 조성물 및 다른 산소 농도의 영역으로 포함하는 복잡한 3 차원 마이크로 구조를 갖는다. 이러한 복잡한 구조를 고려할 때 시험 관내 ⁽¹⁾ 적절한 간 모델을 만드는 것이 어려웠다. 그러나, 시험 관내 모델에서 기능 테스트 약물 독성 ² 플랫폼 인간 간세포를 호스팅 간 ^3과 관련된 질환을 연구하는 수요가있다.

현재 간암 조직 공학 플랫폼 조나의 생화학 적 조성물을 분리, 또는 간장의 파라미터 중, 몇 개의 셀 ⁽⁴⁾ 즉, 공존 배양을 집중하여 간암의 복잡성을 단순화 한L 개의 미세 환경 ⁵ 유동 역학 ^6,7 및 biomatrix ^8의 구성. biomatrix 구성은 지지체 물질, 세포 외 기질 (ECM) 단백질 조성물, 매트릭스 경도뿐만 아니라 지지체의 디자인 및 구조와 같은 파라미터로 나눌 수있다. 조정 하이드로 겔의 기계적 특성, 생체 활성 및 열화 율에 기능 부여, 합성 하이드로 겔, 특히 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG)을 사용하여 하이드로 겔 ⁹ 조직 공학 연구의 증가가 있었다. 간 관련 연구와 관련하여, 생체 적합성 하이드로 겔은 간 질환 ^3의 바이러스 감염 연구에 적용 하였다. 간세포 플랫폼 설계로서 수많은 연구는 생체 내 미세 환경에서 모방 필수적인 차원 환경과 셀 ECM 및 세포 - 세포 상호 작용을 제공하기 위해 하이드로 겔 ^{(12, 13)} 내에서 간세포 샌드위치 배양 ^10,11 세포 캡슐화를 이용했다. 하우버전, 이러한 플랫폼은 지지체 ^(14)를 통해 비 균일 한 특성을 선도, 제어 및 공간 조직의 높은 수준을 가지고 있지 않습니다.

반전 결정 콜로이드 (ICC)는 ¹⁴ 비계 먼저 2000 년대 초반에 도입 된 세포 배양을위한 매우 조직 차원의 발판이다. 발판의 독특한 구조는 콜로이드 성 결정 가변 직경의 콜로이드 입자의 정 합체를 이용하여 간단한 제조 공정에 기인 할 수있다. 간략하게, 프로세스를 요약하기 위해, 입자는 깔끔하게 배치 격자를 형성하는 열을 이용하여 어닐링된다. 고 표면적을 갖는 육방 충전 구형 캐비티 ^(15)의 중합 된 겔 결과, 유기 용매에 의한이 격자의 침출. 이 높은 순서 지지체 이전 (아크릴 아미드) ^16-21, 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산), 폴리에 한정 ^15,22-30, 합성 및 천연 재료 모두에서 만들어진 포함하되되었는지폴리 (에틸렌 글리콜) ^{(31, 32),} 폴리 (2- 히드 록시 에틸 메타 크릴 레이트) ^21,33-35, 키토산 ^36-39. 비 오염 물질로 만들어진 ICC의 발판이 공동 ^14,23,40 내에서 세포 회전 타원체를 촉진하는 경향이있다. 여러 종류의 세포가 성공적으로 셀 ^{(43, 44)을} 확산이 구성에서 차별화 기능 연골 ^41, 골수 간질 세포 ^(42)를 포함하고, 줄기 밝혀졌다. 간세포 대해서는 연구 된 ICC 나 _{2 SiO3과} 폴리 (아크릴 아미드)로 이루어지는 지지체 아니라 PEG로 수행되었다. 간단한 바이오 콘쥬 게이션 전략 (즉, EDC / NHS를 통해 아민 커플 링), ECM 단백질 공역 PEG 기반의 발판이 환경과 같은 생체 내에서 더를하고 간 기능을 향상시키기 위해 더 많은 세포 결합 부위를 입증 할 수있는, 제조 할 수있다.

이 원고 및 관련 비디오에서 세부 사항에게 ICC 지지체의 제조를 우리(허 7.5) 배양 간암에 최적화 된 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트 (PEGDA), 하이드로 겔 및 폴리스티렌 미세 구조 격자를 사용. 우리는 비계 토폴로지 및 전지 성능의 관점에서 일반적으로 비 접착식 베어 PEGDA의 ICC의 발판과 콜라겐 코팅 PEGDA의 ICC 지지체의 차이점을 보여줍니다. 세포 생존 및 기능이 허 - 7.5 셀 행동을 평가하는 정 성적 및 정량적으로 측정한다.

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프로토콜

1. ICC의 비계 제작 (그림 1)

1. 폴리스티렌 (PS) 울타리 (비드의 8-13 층 직경 = 6 mm)를 준비합니다.
   1. 40 μl의 수준에서 0.2 ml의 증발 증거의 microcentrifuge 튜브에서 팁을 절단, 금형을 제조 하였다. 방수 접착제 24 X 60mm ⁽²⁾ 현미경 커버 유리 전표에 컷 튜브의 상단을 준수합니다.
   2. 신중하게, 20 ml의 유리 병에 물 현탁액에 포함 된 PS 구 (직경 = 140 μm의)를 넣어 물 현탁액을 피펫, 그리고 유리 병에 18 ml의 70 %의 에탄올 용액을 추가합니다. 집계 구를 풀어 초음파 욕조에 구 솔루션을 넣습니다. 완전히 물 및 수용성 성분을 제거하기 위해 세정 공정이 여러 번 반복.
   3. 몰드에 에탄올 100 μL 피펫.
   4. 4mm하여 200 μL의 마이크로 피펫 팁의 상단을 잘라. 회를 달성하기 위해 200 ㎕를 마이크로 피펫을 사용하여 몰드로 분야의 25 μL 피펫각각의 금형에 50 μL의 총 부피.
   5. 120 rpm으로 하룻밤에 흔들 통에 금형을 놓습니다.
   6. 광학 현미경으로 각 금형의 구체의 배열을 확인합니다. 구체가 육방 정렬되지 않은 경우, 70 % 에탄올의 50 μL를 추가 한 구성을 정정하기 종횡 축 방향으로 수동으로 흔들.
   7. 이틀 동안 실온 (RT)에서 에탄올의 증발을 보자. 의 PS 구슬을 어닐링 6 시간 동안 130 ℃로 가열로에서 금형 및 비드 단지를 배치합니다.
2. 베어와 ECM 코팅 PEGDA의 발판을 준비.
   1. (= 4.6 kDa의 _승 M)를 선형 PEG의 거대 단량체를 아클을 위해 설립 프로토콜 ^{45, 46을} 사용하여 PEGDA의 거대 단량체를 합성.
   2. 탈 이온화 (DI) 물에 PEGDA 용액 (V / w) 50 %를 준비하고 로머가 제대로이 완전히 용해 될 때까지 4,713 XG에서 원심 분리하여 용해 할 수 있습니다.
      1. ECM 공액 ICC 지지체를 들어, 추가 용해10 % 50 % PEGDA 솔루션에 아크릴로 일 - PEG-NHS (M 3.4 = _w kDa의) (V / w).
   3. 20 %를 준비 '2- 히드 록시 - (4)의 스톡 용액 (/ V w) - (2- 히드 록시에 톡시) -2- methylpropiophenone (PI) 70 % 에탄올이다.
   4. 20 % 50 % 1 ㎖ 당 (w / v)의 PI 원액의 50 μl를 추가 (W / V) PEGDA의. PEGDA의 분자량에 기초하여 PI 원액의 필요한 양을 조정한다.
   5. 소용돌이 1 분 동안 원심 분리 관에 가하여 균일 용액에 도달한다.
   6. 필 (단계 1.1.7에서) 유리 슬라이드에서 금형은 금형에서 접착제를 제거 조심스럽게 주걱을 사용하여 격자를 밀어 1.5 ML 튜브로 각각 배치합니다. 5 분 845 XG에서 PEGDA 솔루션 및 원심 분리기의 피펫 300 μL는 격자에 적절한 PEGDA 솔루션 침투를 허용합니다.
   7. 핀셋을 사용하여 튜브의 격자를 제거하고 조심스럽게 장갑 건조 초과 PEGDA 솔루션을시킨다. 평면 CIR과 파라핀 필름 피복 유리에 격자를 배치이 위를 향하도록 큘라면.
   8. 자외선 자리 램프를 사용하여 5 분 동안 365 nm의 자외선 (UV) 빛 (10.84 mW의 / cm ^2)에 PEGDA 솔루션 침투 발판을 노출.
   9. 새로운 유리 병에 PEGDA 중합 결정 격자를 놓고 테트라 히드로 푸란 20 ㎖를 추가 (THF) (10 바이알 당 그릴 정도). 300 rpm으로 궤도 통에 유리 병을 흔들어. 1-2 시간의 간격으로 THF에게 적어도 3 회를 변경합니다.
      참고 차례로 PS의 불완전한 제거를 일으킬 수있는 발판을 기포가 들어 가지 않도록하기 위해, THF를 변경할 때 완전히 THF를 제거하지 않는다. 격자를 커버하고 새로운 THF를 추가 할 수있는 충분한 솔루션을 둡니다.
      주의 : THF 독성이다. 장갑, 실험실 코트와 고글을 착용 할 것. 흄 후드에서 작동하여 흡입을 피할 것.
   10. PS 구가 사용 된 THF 용액에 물을 넣고 용액의 색을 관찰하여 용해되어 있는지 확인합니다. 의 PS 분야가 제대로 용해되지 않은 경우 단계를 반복 1.2.9.
       참고 :이 솔루션의 색상이 변경됩니다백색 잔여 PS 분야가있는 경우.
3. 바이오 안전성 캐비닛 (BSC)의 발판을 청소합니다.
   1. 골격을 살균, 지지체 당 70 % 에탄올 2 ㎖와 50 ㎖ 원심 분리 튜브를 준비하고, 주걱을 이용하여 튜브 내의 지지체를 배치. 골격이 1 시간 동안 에탄올에 담가 할 수 있습니다. 앞으로이 단계에서, BSC 모든 절차를 수행.
   2. 조심스럽게 에탄올을 부어 3 분 거품을 제거하기 위해 524 XG에 인산 완충 식염수 (PBS) (비계 당 2 ㎖) 및 원심 분리기로 교체합니다. 냉장고에 보관하고 1 ~ 2 시간의 간격으로 PBS를 몇 번 변경합니다.
      1. 콜라겐 유형, 콜라겐 타입 1 원액을 포함하는 다른 50 ML의 원심 분리기 튜브 (비계 당 1 ㎖) 준비 3 분 동안 524 XG에 주걱, 원심 분리기를 사용하여이 튜브에 소독 발판을 전송 발판을 나는 코팅. 30 분 동안 궤도 통에 400 rpm에서 공사장 공중 발판을 흔들어하고 냉장고에 튜브를 유지또는 밤새.
      2. PBS를 흡입 한 다음 신선한 PBS의 발판을 잠수에 의해 두 번 사용하기 전에 PBS로 발판을 씻으십시오.
         주 : NHS의 화학 결합 (도 2)을 형성하는 아민기를 필요로하기 때문에 다른 ECM 단백질 대신 콜라겐 I 형으로 사용될 수있다.

ICC 제조 1. 개요도. PEG 기반 ICC의 발판 함께하고 ECM-작용하지 않고 미세 가공 기술을 사용하여 제조된다. ECM 코팅 ICC의 발판은 PEG-NHS뿐만 아니라 PEGDA (그림 2에 설명 된대로)가 필요합니다. 추신 격자 6 mm의 직경과 8-13 비드 층의 높이를 갖는다. PS, 폴리스티렌; PEGDA, 폴리 (에틸렌 글리콜) 디 아크릴 레이트; UV, 자외선; THF, 테트라 하이드로 푸란; ECM, 세포 외 기질. 이 그림은 수정 및 Wi에서 허가를 받아 사용되었습니다목초지 ^(47). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. ICC 구조 특성

1. , 또는 공액 단백질없이 ICC 구조 분석 주사 전자 현미경 (SEM) ^(47)를 사용한다.
   1. 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)와 비계 해결 직렬 25, 50, 75, 95, 100 % 에탄올 솔루션을 탈수하고, 에탄올이 완전히 증발 될 때까지 -80 ℃에서 보관.
   2. 48 시간 동안 동결 건조기에서 건조 샘플.
   3. 스퍼터 코팅기에 탄소 테이프와 장소를 사용하여 샘​​플 홀더 상에 샘플을 부착합니다.
   4. 자동 진공 청소기로 청소 한 후, 20mA에서 60 초 동안 스퍼터링 10 나노 미터 두께의 Pt 막 코트를.
   5. 5 kV의 (도 3a,도 4a)의 전압을 사용하여 SEM 이미지 ICC 지지체.
2. 기공을 측정하고공동 배선 직경은 이미지 분석 소프트웨어 ⁽⁴⁸⁾ (도 3B, C 예 ImageJ에)을 이용하여 SEM 현미경 사진을 분석한다.
3. 세포가없는 지지체에 접합 된 콜라겐, 형광 태그를 시각화하는 항체 (1 : 100)를 이용하여 콜라겐 공 초점 레이저 주사 현미경 ^(47)과 콜라겐 타입 I 화상에 대해 (CLSM을,도 4b).

3. 허 - 7.5 세포 배양 및 시드

1. 10 ㎖ 둘 베코 변형 이글 배지에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 (DMEM), 100 U / mL를 100mm 세포 배양 접시에서 2-2.5 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 접종 밀도로 배양 응 7.5 세포 BSC에 37 ° C에서 페니실린 - 스트렙토 마이신 (성장 미디어), 5 % CO _2. 변경 미디어 3 일마다 그들은 75-80%의 포화 상태에 도달 할 때까지.
2. BSC에 세포의 파종을위한 발판을 준비합니다.
   1. 조심스럽게 scaff를 배치평면과 24 웰 플레이트에 어린이가 위를 향.
   2. 각 웰 발판을 포함하여 비계, 피펫 2 ml의 PBS를 세척합니다. PBS를 피펫 2ml를 각 웰에 신선한 PBS를 대기음.
   3. PBS를 성장 미디어 피펫 2 ml에 기음 (단계 3.1 참조), 30 분 동안 둡니다. 미디어를 기음과 비계가 1 시간 동안 건조 할 수 있습니다.
3. 트립신 소화 방법을 사용하여 BSC의 문화 판에서 (3.1 단계)에서 합류 허 - 7.5 세포를 분리합니다.
   1. 접시에서 대기음 매체는 부착 세포를 씻어 4 ml의 PBS를 추가 한 후 PBS를 대기음.
   2. 피펫 37 ° C에서 인큐베이터에 0.75-1 ml의 0.25 % 트립신과 장소, 5 %의 3 분 CO _2.
   3. 트립신의 반응을 정지 인큐베이터와 피펫에서 5 ml의 미디어를 플레이트를 제거합니다. 15 ML 튜브에 피펫 미디어, 분리 된 세포 및 트립신 혼합물.
   4. 3 분 동안 524 XG에 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 5 ml의 미디어 펠렛을 재현 탁.
4. 혈구를 사용하여 세포를 세어 25 μL 당 대상 번호, N ₀ 세포를 포함하는 세포 현탁액의 양을 계산한다 (표준 실험을 위해, N _0는 1 × 10 ⁶ 세포이다).
   세포 현탁액 부피 = (셀의 목표 개수) / (세포 현탁액의 농도)
5. 천천히 직접 (단계 3.1.4에서) 각 지지체 위에 세포 현탁액 (포함 N ₀ 세포)의 25 μl를 피펫. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다.
6. 12 시간 후, 각 웰에 새로운 24 웰 플레이트 피펫에 주걱의 사용으로주의 깊게 미디어 2 ㎖을 발판을 전송합니다. 인큐베이터에서 24 웰 플레이트를 놓습니다.
7. 3 일마다 미디어를 변경하거나 미디어는 단백질 분비 분석 (단계 5.1 참조)를 수집하는 경우에 따라 다릅니다.

4. 세포 생존

1. 질적으로 세포 생존율을 분석하기 위해, C를 사용하여 세포와 이미지를 얼룩 형광 라이브 / 죽은 염색 키트를 사용하여LSM.
   1. 키트 지시에 따라, 4 μM의 칼 세인의 AM 8 μM 티듐 호모 다이머 -1 매체로하는 용액을 제조한다 (단계 3.1.3 참조).
      참고 : 셀 수에 따라 최적화 할 수 있습니다. 세포 증식 및 (2 백만 정도) 수의 두 경우 시약의 두 배를 사용합니다.
   2. BSC에에서 잘 발판 (단계 3.7) 및 피펫 제조 된 용액 500 μL와 각각 흡인 미디어. 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 샘플을 품어.
   3. 인큐베이터에서 접시를 제거 할 때 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 호일로 접시를 커버. CLSM49를 사용하여 이미지 샘플.
2. 정량적 (생균에서) 효소 활성을 측정하는 비색 분석법 ^(50)를 사용하여 세포 생존율을 평가하기 위해 (즉, 2- (2- 메 톡시 -4- 니트로 페닐) -3- (4- 니트로 페닐) -5- (2,4- 디 술포) -2H-테트라 졸륨 (모노 나트륨 소금 시약)).
   1. 국제 형사 재판소 플랫폼을위한 표준 곡선 (흡광도 (OD) V의 즉, 그래프 작성ersus) 휴대폰 번호 부여.
      참고 : 세포 골격의 공동 통과 할 수 있기 때문에 셀 시드가, 다른 플랫폼에 비해 100 % 효율적이다.
      1. 표준 곡선을 만들기 위해 사용되는 세포 시딩 번호, N _{0을 결정한다.}
         참고 : 실험 추정되는 세포 수를 포함하는 범위를 선택합니다. 예를 들어, 초기 셀 수가 5 × ¹⁰⁵ 세포이고, 2.5 × ^105, 5 × ^105, 1 × ^6, 2 개 선택 실험 마지막 날에 의해 약 2 ~ 3 배의 증가가 있으면 N _0과 같은 10 ⁶ 세포.
      2. 단계 3.1-3.6에 설명 된대로 ICC의 비계 (25 μL의 시딩 볼륨 발판 당 하나의 N _0)에서 셀 시드를 수행합니다.
      3. 6 시간 후, 잘 다른 24 웰 플레이트에 발판을 전송합니다. 세포 부착을 허용하지만 확산 셀하지 않는 시간을 선택합니다.
      4. 전송 된 ICC 지지체에 세포 계산을 수행합니다.
         1. 발판으로 각 웰에 BSC와 피펫 500 μl의 1 배 MSR 솔루션에서 미디어 배로 10 배 모노 나트륨 소금 시약 (MSR) 솔루션을 희석. 1 시간 동안 37 ° C에서 24 웰 플레이트를 인큐베이션.
         2. 각 웰에서 웰 96 웰 플레이트에 100 μL 옮긴다. 빈, 피펫 96 웰 플레이트에 다른 우물에 신선한 1X 모노 나트륨 소금 시약 용액 100 ㎕로. 수동 광으로부터 보호하기 위해 호일의 96- 웰 플레이트 기포 드라이 피펫 팁을 이용하여 제거하고 커버 선물합니다.
         3. λ = 450 nm에서 측정 OD는 분광 광도계를 사용하여 읽기. 정확한 OD ^(51)를 찾기 위해 다른 값에서 빈 OD를 뺍니다.
      5. 혈구를 사용하여 지지체 (단계 4.2.1.3)을 전사 한 후 웰에 남아있는 세포의 수 (N의 _L)를 계산.
         참고 : 세포를 Trypsinize하는 트립신의 300 μl를 사용합니다.
      6. 실제 세포 수, _{n은을 계산합니다.}
         실제 =초기는 - 잘 남아
         N _A = N ₀ -N _L
      7. 대 실제 세포 수 (N _A) 단계 4.2.1.4.3에서 얻은 OD를 플롯하여 표준 곡선을 확인하고 실험에서 세포 수를 추정 할 때 사용합니다.
         주 : ICC 매개 변수 (즉, 기공 크기, 발판의 치수, ECM 단백질 등)이 변경되면 새로운 표준 곡선을 확인합니다.

5. 세포의 기능

1. 효소에 의해 (단계 3.7)에서 수집 된 미디어에서 허 - 7.5 세포 (즉, 알부민, 요소)에 의해 단백질 분비 분석은 면역 분석법 (ELISA) ^(52)을 연결.
   주 : 미디어 희석 시드 셀의 개수와 수집 매체의 양에 따라. 항체 예비 피복 된 웰에 도입되기 전에, 비 25 : 5 × ¹⁰⁵ 세포로 시딩 ICC를 들어, ~ 1를 사용한다.
2. 질적으로 세포 기능을 분석하기 위해, 특정 세포 내 단백질 발현 사이(즉, 알부민), 효소 (즉, CYP450), 얼룩 구조 구성 요소 (즉, 세포의 액틴)뿐만 아니라 핵 및 CLSM ⁴⁹ 사용 이미지입니다.
   1. 피펫 2 ml의 PBS (단계 3.7)에서 대기음 매체는 셀 - 라덴 ICC의 발판을 씻어.
   2. 피펫 한 4 % PFA ml의 고정을 실온에서 5 분 동안 배양한다.
   3. 2 ml의 PBS로 세척 배.
   4. 30 분 동안 0.1 % 4- (1,1,3,3- 테트라 메틸 부틸) 페닐 - 폴리에틸렌 글리콜 (계면 활성제)의 1 ml의 골격을 배양하여 막을 Permeabilize 하시려면.
   5. 2 씻을 배는 PBS는 누출 단백질을 제거 ml가.
   6. 피펫 500 ㎕의 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 비특이적 결합을 차단하기 위해 1 시간 동안 RT에서 배양한다.
   7. 희석 차 항체 (즉, 알부민, CYP450) 솔루션을 준비합니다.
      1. 피펫 (500) 15 ㎖의 튜브에 1 % BSA 용액 μL와 총 5 ml를 0.1 %의 BSA 용액을 제조 4.5 mL의 0.1 % 계면 활성제 용액을 추가한다.
      2. 피펫 200 μL의 마이크로 원심 튜브에 0.1 % BSA 용액 98 μL와 1:50 생산할 차 항체 2 μL (차 항체를 0.1 %의 BSA) 차 항체 용액.
   8. 피펫 (40) 발판의 기본 항체 솔루션의 μL 및 파라핀 필름 기판을 커버한다. 알루미늄 호일로 24 웰 플레이트를 감싸고 밤새 4 ° C에서 접시를 저장합니다.
   9. 2 ml의 PBS로 세척 배 세척 사이에 부드럽게 판을 흔들어.
   10. 희석 바이오틴 차 항체 (즉, 안티 - 마우스 항체) 주식 솔루션을 준비합니다.
       1. (100) (차 항체 : 0.1 % BSA) 이차 항체 용액 198 ㎕를 피펫 0.1 % BSA 용액 2 ㎕의 제 1 항체를 생성한다.
       2. 0.1 %의 BSA 용액 중 로다 민 또는 형광 표지 팔로이 딘 (셀룰러 액틴 필라멘트 얼룩)의 0.1 % 스톡 용액을 준비한다.
       3. 피펫 용액 각 25 μL를 튜브와 혼합 승엘.
   11. 피펫 발판에있는 이차 항체 원액의 50 μL. 파라핀 필름 발판을 덮고 2 시간 동안 실온에서 알루미늄 호일 및 저장과 요리를 포장.
   12. 2 ml의 PBS로 세척 배.
   13. 피펫 0.2 % 4'-6-diamidino-2-페닐 인돌 200 μL (DAPI, 핵 얼룩) 발판에 솔루션 2-3 분 동안 실온에서 보관하십시오. 알루미늄 호일로 접시를 커버.
   14. 2 ml의 PBS로 세척 배.
   15. 점 적기를 사용하여 기판 상에 실장 미디어 방울을 놓는다.
   16. 조심스럽게 CLSM ^47를 사용하여 유리 슬라이드 및 이미지에 발판을 넣어.
3. 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR의)에 의한 유전자 발현을 평가한다. 역전사 PCR (RT-PCR) ^(53)와 제조업체의 지침에 따라 qPCR에 ^(54)에 대한 표준 키트를 사용합니다. 아래에 설명 된대로 세포에서 RNA를 추출합니다.
   1. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 (단계 3.7에서) 발판을 놓으십시오.
   2. 튜브로의 RNA 추출 용액을 피펫 1 mL 및 실온에서 5 분간 초음파 처리에 유의하십시오.
   3. 각각의 microcentrifuge 튜브에 클로로포름 200 μl를 피펫과 15 ~ 20 초 동안 손에 적극적으로 튜브를 흔들. 위상이 분리 될 때까지 2 ~ 3 분 동안 실온에서 튜브를 유지합니다.
   4. 13,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기와 위상이 혼합되지 않도록 조심스럽게 튜브를 제거합니다.
   5. 조심스럽게 초 미세 원심 관에 제 1 튜브의 상부 수성상의 500-600 μL 피펫.
   6. 이 두 번째 튜브에 이소프로판올의 동등한 볼륨 (500-600 μl를) 추가합니다.
   7. 튜브를 3-5 회 전환하고 10 분 동안 RT에서 서 튜브를 떠난다.
   8. 13,000 XG, 15 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기.
      1. 펠렛을 5 분 동안 다시 튜브, 원심 분리기의 하단에 표시되지 않는 경우.
         주 : 여전히 가시적 펠릿이 없으면 RNA의 양이 불충분 할 수있다.
   9. 나는튜브에 DEPC 물에 희석하여 1 ml의 70 % 에탄올에 뜨는 및 피펫을 폐기 열린 모자와 nvert 튜브.
   10. 펠렛은 튜브의 벽에서 분리 약간 튜브를 와동 후 튜브 공기 건조를 할 수 있습니다.
   11. 펠렛을 재현 탁하는 DPEC 물 50 μl를 추가합니다.
   12. 펠릿 용해 될 때까지 피펫을 유지합니다.
   13. 단일 가닥 RNA에 이중 가닥 RNA를 변성하기 위해 55 ° C에서 10 분 동안 유지.
   14. 가볍게 튜브 간단히 원심 분리 한 다음 (7,500 XG, 4 분, 4 ° C)를 튜브 바닥에 손가락을 드럼합니다.
   15. ^56에서 설명한대로 역전사 효소 ⁽⁵⁵⁾ 및 실시간 PCR을 수행 할 때까지 얼음 튜브를 유지한다.

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결과

국제 형사 재판소 지지체의 구조 특성 및 간세포를 배양의 각 ICC의 발판 조건의 효능의 비교에 대한 대표적인 결과가 표시하고 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 결과에서 사용 ICC 골격 조건은 0 μg의 / ㎖ (맨발), 20 ㎍ / ㎖ (콜라겐 20), 200 ㎍ / ㎖ (콜라겐 200) 및 400 ㎍ / ㎖ (400 콜라겐) 및 초기의 콜라겐 코팅되어 허-7.5 셀 시드 수는 1 × ^6입니다.

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토론

조직 공학 발판 빠르게 모든, 재생 유지, 또는 약물, 질병을 연구, 개발, 장기 교체 응용 프로그램에 대한 조직을 복구하는 데 필요한 물리적, 생화학 적 단서, 그리고 많은 다른 ^57를 제공하기 위해 진화하고있다. 간 조직 공학에서 차 인간 간세포 빠르게 한 번 몸에서 격리 대사 기능, 엔지니어링 발판을위한 훌륭한 필요성을 생성하고 간 기능을 유지하기 위해 플랫폼 개발을 잃게됩니다. <...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 ml PCR tube	Axygen Scientific	PCR-02D-C	Boil-proof
Gorilla Glue	Gorilla Glue, Inc.	Depends on vendor. This was purchased from a local store.
Glass slides	VWR	631-1575	Dimensions: 24×60 mm2
Polystyrene spheres	Fisher Scientific	TSS#4314A	Diameter = 140 µm; 3x104 particles per milliliter and 1.4% size distribution
Ethanol	Merck	1.00983.1011	absolute for analysis EMSURE; Dilute to 70% with Milli-Q water
Ultrasonic Bath	Elma	S10H	Equiment
Furnace	Nabertherm	N7/H	Equipment
200 µl pipette tip	Axygen Scientific	T-210-Y-R-S
Rocking shaker	VWR	444-0142
Polyethylene Glycol (PEG)	Merck	1.09727.0100	Mw= 4 kDa; acrylation of PEG monomers and purification of the resulting precipitate produces a PEGDA macromer with Mw = 4.6 kDa
Centrifuge	Beckman Coulter	392932	Equipment
Acrylate-Poly(Ethylene Glycol) - Succinimidyl Valerate	Laysan Bio	ACRL-PEG-SVA-3400-1g	Mw = 3.4 kDa
2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma Aldrich	410896
Vortex	VWR	58816-123	Equipment
Microcentrifuge	Eppendorf	5404 000.413
Paraffin Film	Parafilm M	#PM996	Kept at 9" with allows intensity of 10.84 mW/cm2
Bluewave 200 UV spotlight	Blaze Technology	120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF)	Merck	107025
Orbital shaker	Heidolph	543-123120-00-5
Collagen Type I	Sigma Aldrich	C3867-1VL	From rat. 1x, w/o CaCl2 & MgCl2; pH = 7.2
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	20012-027	16% W/V AQ. 10 x 10 ml
Paraformaldehyde	VWR	43368.9M	Equipment
Freezone 4.5 freeze drier	Labconco	7750020	Equipment
Sputter coater	Jeol Ltd.	JFC-1600	Equipment
Scanning Electron Microscope	Jeol Ltd.	JSM 5310
Anti-mouse primary antibodies against Collagen type I	Abcam	ab6308
Anti-mouse secondary antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Life Technologies	A21121
Plate, Tissue Culture 24 Well, Flat Bottom (Nunclon)	Bio-Rev PTE LTD	3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM) 2.5 g/L Glucose w/ L-Gln	Lonza	12-604F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	A15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S)	Life Tchnologies	15140-122 E
100 mm Corning non-treated culture dishes	Sigma Aldrich	CLS430591
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Equipment; 37 °C, 5% Humidity
Forma Steri-Cycle CO2 Incubators	Thermofisher Scientific	371
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Thermofisher Scientific	02-671-6
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells	Life Technologies	L3224
CCK-8 Assay	Dojindo Laboratories	CK04-11	Monosodium-salt reagent (MSR)
Infinite 200 PRO microplate reader	Tecan
Albumin Human ELISA kit	Abcam	ab108788
Triton X-100	Bio-Rad	#1610407
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-50G
Anti-mouse primary antibodies (against CYP3A4, albumin)	Santa Cruz Biotechnology	sc-53850; sc-271605
DAPI	Life Technologies	D3571
Alexa Fluor 555 labeled Phalloidin	Life Technologies	A34055
Trizol	Life Technologies	15596-026
Chloroform	VWR	22706.326
Isopropanol	Fisher Scientific	67-63-0
DPEC water	Thermofisher Scientific	AM9916
Nanodrop 2000c Spectrophotometer	Thermofisher Scientific	ND-2000
iScript Reverse Transcription Supermix	Bio-Rad Laboratories	1708840
SYBR select Master Mix for CFX	Life Technology	4472937
Primers (to be chosen)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler	Bio Rad Laboratories	SOFT-CFX-31-PATCH