시 냅 스 아연 Histochemistry 다른 지역과 개발 및 성인 두뇌에서 하기의 사용

요약

우리는 서로 다른 뇌 영역에 패턴을 얼룩이 지기 특성 박판 모양 및 면적 아연을 조직화 학적인 절차를 설명 합니다. 아연 얼룩 패턴 함께에서 다른 해 부 마커와 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌에서 안정적으로 구별 하 사용할 수 있습니다.

초록

해 부 학적 및 기능적 뇌 조직 및 개발의 고유한 신경 회로 지역 미 숙 하 고 성인 두뇌의 정확한 식별을 필요합니다. 여기는 다른 레이어 및 두뇌 영역 중에서 얼룩 패턴에 차이 밝혀 아연 조직화 학적인 얼룩 절차에 설명 합니다. 다른 사람을 아연 포함 된 신경 및 두뇌에서 회로의 분포 뿐만 아니라 성공적으로 여러 종에서 개발 및 성인 두뇌에 있는 영역 및 박판 모양 경계 윤곽을 그리 다이 절차를 활용 했습니다. 여기 우리가 설명이 절차 개발에서 이미지와 함께 얼룩 및 성인 흰 족제비 두뇌. 우리는 아연 얼룩 패턴 영역과 레이어의 해 부 감 적 역할을 계시 하 고 개발 및 성인 시각 피 질에서 시각 피 질 영역을 구별 하 안정적으로 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 레이어 및 지역 개발 및 성인 두뇌 그렇게 할 다른 방법이 실패 하는 곳에서 정확한 식별 수 있도록 조직화 학적인 방법을 제시 하는. Secondarily, densitometric 이미지 분석 함께,이 방법을 하나 수 있습니다 개발을 통해 잠재적인 변화를 공개 시 냅 스 아연의 분포를 평가 하. 시 약, 도구, 및 연속적으로 냉동된 뇌 섹션 얼룩 필요한 단계가이 프로토콜은 자세하게에서 설명 합니다. 하지만이 프로토콜 사용 하 여 흰 족제비 뇌 조직의 설명, 그것은 쉽게 설치류, 고양이, 또는 다른 뇌 영역에서 뿐만 아니라 원숭이에 사용 하기 위해 적용할 수 있습니다.

서문

조직학 얼룩 전통적으로 건축 술 기능에 차이 공개 하 여 다양 한 종에서 대뇌 피 질의 영역 식별에서 돕기 위해 사용 되었습니다. 그들은 두뇌의 비슷한 면적 경계 공개 Nissl 물질, 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 반응, 또는 수 초 같은 조직화 학적인 기술 사용 유익한 증명할 수 있다. 그러나, 이러한 조직화 학적인 얼룩 대뇌 피 질의 영역 및 미 성숙한 뇌에 레이어 사이의 명확한 경계를 항상 적절 하 게 공개 하지 않습니다.

중앙 신 경계, 아연에는 효소 공동 인자, 다양 한 규제 기능에 참여 하 고 시 냅 스 소포에 그것의 존재를 통해 neuromodulator 역할 역할 DNA 구조 안정화를 포함 하는 몇 가지 중요 한 기능 ¹. 시 냅 스 아연은 독특한 그것은 구상 될 수 있다 조직학 방법 반면 단백질 바인딩 아연 시각된²수 없습니다. 이 기능은 다른 대뇌 피 질의 영역에 시 냅 스 아연 패턴을 이용 되 고 시 냅 스 아연 histochemistry 연구의 숫자에 사용 되었습니다. 대뇌 피 질 신경 세포 glutamatergic의 하위 집합 포함 그들의 축 삭 맨끝^3,4내 연 접 소포에 아연. 조직화 학적인 연구는 대뇌 피 질^5,,67에서 시 냅 스 아연의 다른 유형의 분포를 계시 했다. 다른 대뇌 피 질의 영역 (예를 들어, 시각적 somatosensory 피 대), 또는 레이어 histochemically 반응 아연의 다른 영역 및 층 류 분포 나타납니다 (예를 들어,는 supragranular에 있는 아연 수준 및 기본 시각 피 질 infragranular 레이어는 상대적으로 낮은 시 냅 스 아연 레벨 thalamocortical 입력 계층 4 보다 실질적으로 더 높은)^5,,89. 면적 및 층 류 식별을 용이 하 게 하는으로 시 냅 스 아연 피 질에 얼룩에 특히 유리 하다.

여기 우리는 Danscher의 1982 메서드¹⁰의 수정된 된 버전은 시 냅 스 아연 조직화 학적인 절차에 대 한 자세한 설명을 제시. 이 메서드는 chelating 에이전트로 동물에 selenite intraperitoneally 주입 (IP)를 사용합니다. selenite 두뇌 glutamatergic 시 냅 스의 부분 집합의 소포에 있는 자유로운 아연의 수영장으로 반응 하는 뇌에 여행. 이 반응은 실버 개발^2,,1011이후 강화 될 수 있다 침전을 생성 합니다.

이 절차 시 냅 스 아연 얼룩;의 층 류 영역 패턴을 보여준다 densitometric 분석은 성인과 미 성숙한 뇌의 감각, 환경, 약물, 또는 유전자 조작 같은 다른 개입의 효과 연구에서 이러한 패턴을 질적 및 양적 평가를 사용할 수 있습니다. 또한, 하나 또한 다른 모델 시스템에 다른 피 질 또는 subcortical 구조에서 시 냅 스 아연의 분포에 잠재적인 발달 변화를 평가 하 고 있습니다. Densitometric 분석이 메서드에서 제공 하는 양적 정보는 시간이 지남에 따라 다음 두뇌 개발을 위한 유리한 될 수 있습니다. 이 프로토콜을 다른 면역-조직화 학적인 마커 동반자를 층 류 및 영역 경계를 표시를 제공 합니다.

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프로토콜

는 다음 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 도시 대학의 뉴욕, 모든 적절 한 주 및 연방 정부의 지침에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따릅니다. 마 취 흰 족제비에 대 한 적합 하 고 공부 하는 종에 따라 수정 해야 합니다.

그림 1:이 프로토콜의 3 단계에서 관련 된 주요 단계를 설명 하는 순서도 그리고 각 단계를 완료 하는 데 필요한 시간. 흰색 텍스트 원형에서 다른 모든 단계는 완전히 건조 섹션을 요구 하는 기간 녹색 텍스트 원에 표시 됩니다. 녹색 다이아몬드 모양의 텍스트 상자가 결정, 동안 빨간 사각형 중요 한 단계 이며 여분의 주의 수행 되어야 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

1. 준비 단계 (쓴 슬라이드 솔루션 만들기)

1. 뜨거운 물에 세제와 함께 unsubbed 슬라이드를 세척 및 증류수 린스를 철저 하 게 어떤 먼지를 또는 파편 든 지 제거와 함께 다음 따뜻한 물에 여러 번 씻어. 슬라이드 37에 오븐에서 또는 실내 온도에 건조를 허용 ° c.
2. 슬라이드 완전히 건조 되 면 달걀 흰색의 얇은 코트 레이어 손가락 또는 그림 붓을 사용 하 여 각 슬라이드에. 20-30 분 동안 60 ° C에 오븐에 건조를 허용 합니다. 최적의 결과 위해, 섹션에서 미 끄 러 방지 하기 계란 흰색의 두 번째 코트를 추가 하 고 60에서 오븐에 한번 더 건조 수 ° c.
3. 뜨거운 물 (60 ℃) 100ml에 젤라틴의 1 그램을 용 해 하 여 1% 젤라틴 솔루션을 준비 하 고 실내 온도에 냉각.
4. 섹션 4에서에서 사용 하기 위해 아래 설명 된 대로 개발자 솔루션 200ml를 준비.
5. 준비 껌 아랍어 솔루션 천천히 뜨거운 물 (그것은이 방법으로 더 쉽게 해소) 120 mL 단위로 40 g을 추가 하 여
   . 계속 교 반 막대 유리 솔루션을 저 어. 솔루션 완전히 해산 했다, 일단 열에서 그것을 제거 하 고 몇 분 동안 냉각 후 거 즈 천으로 퍼 널에서의 6-8 층 통해 필터링.
   1. 준비 시트르산 20 mL dH ₂ O 5.04 g 연산 플러스 4.7 g 나트륨 구 연산 염을 추가 하 고 혼합물을 용 해 하 여 버퍼입니다. 이 솔루션의 pH 4.0 25 인지 확인 ° C. 조정 솔루션에 수산화 나트륨 또는 염 산을 추가 하 여 필요한 경우 pH.
   2. 30 mL dH ₂ O 난방 Hydroquinone의 1.7 g를 용 해에 의해 Hydroquinone 솔루션 준비.
      참고: 하이드로 퀴 논은 실내 온도에 물에서 쉽게 분해할 수 있는 물에 쉽게 용 해 수 있도록 필수적 이다 hydroquinone 솔루션을가 열. 60 ° c의 온도 유지 조심, 그렇지 않으면 hydroquinone 산화 될 수 있습니다. 솔루션 노란색, 삭제 하 고 다른 신선한 솔루션 준비.
   3. 준비 실버 0.22 g dH ₂ 오 30 mL에 용 해 하 여 솔루션을 젖이 나올
   4. 혼합 솔루션 (1.4.1-1.4.4) 순서는 그들이 때 반응 (즉, 단면, 건조, 그리고 수정 후)를 수행할 준비가 설명 ( 그림 2). 끝은 젖 산 솔루션을 추가 합니다. 이 단계는 신속 하 게 완료 되 고 개발자 솔루션 섹션은 젖 산 염은 감광 성 반응 시간이 될 때까지 어둠 속에 배치 됩니다 확인 하십시오.

그림 2: 단계에 관련 된 순서를 보여주는 회로도 프로토콜의 아연 histochemistry 단계에는 시 약을 혼합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 동물 치료와 마 취

sedating 동물, 사전 준비 1 mL dH ₂ O. 나트륨 selenite의 10mg을 용 해 하 여 1% 나트륨 (Na ₂ 서구 ₃) selenite 솔루션

1. Anesthetize 케 타 민 (25 mg/kg) 및 xylazine (2 mg/kg)의 근육 내 주입으로 동물.
   주: 마 취의 적절 한 수준의 페달 반사 응답을 사용 하 여 이루어집니다 확인 하십시오.
2. 넣기 아연 chelator 나트륨 selenite 솔루션 (15 mg/kg) intraperitoneally (IP).
   참고: 다른 나가에 또는 다른 종에서 나트륨 selenite의 독성 수 다.
3. 는 나트륨 selenite 뇌에 여행에 대 한 60 ~ 90 분을 허용 합니다. 이 기간 동안, 그것은 동물 제대로 진정 하 고 응답 하지 않는, 그래서 5 분 마다 마 취의 깊이 확인 하는 것이 필수적
4. Selenite 기간 동안 동물 마 취 동안 닫히도록 눈은, 건조를 방지 하거나 안과 연 고 그들을 축축한 유지 관리.

3. 조직 준비 및 얼룩

1. 나트륨 pentobarbital (100 mg/kg, i.p)의 과다 투여 하 여 동물을 안락사.
2. 수행 transcardial 관류 정상적인 생리 식 염 수 1 분 및 20 분에 대 한 4 %paraformaldehyde 마지막으로, 4 %paraformaldehyde 및 10% 자당 (1 h의 총 고정 기간)와 솔루션 관리.
3. 큰가 위의 쌍을 사용 하 여 머리 제거.
4. 중간 절 개 목에 코에서 메스를 사용 하 여 두개골을 노출 하 게.
5. 신중 하 게 두뇌를 제거 하 고 칼 날 반구를 분리.
6. 두뇌의 후부 부분을 차단 하 고 몇 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼 (PB)에 4 %paraformaldehyde 후 위.
7. 0.1 M 샌드위치에 30% 자당 해결책에 블록을 배치 하 고 싱크대 뇌 수.
   참고: 두뇌 제한 두뇌 싱크 0.1 M 샌드위치에 30% 자당 해결책을 바꿉니다 4 %paraformaldehyde 및 30% 자당 해결책 '이 paraformaldehyde s 노출 얼룩 질 조직 영향을 미칠 수.
8. 한번 뇌 싱크, 시각 피 질 또는 동결, 슬라이딩 톰 또는 cryostat에 관심 영역을 통해 반 접선 40 µ m 두꺼운 부분을 잘라. 이 중간으로 블록 아래로 표면 부드럽게 한 유리 슬라이드와 병합을 배치 하 여 수행할 수 있습니다.
9. 페인트 브러시와 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)를 포함 하는 태 클 상자에 저장소 섹션을 수집.
10. 별도 번호 시리즈에는 섹션을 구분합니다. 바로 하나 탑재 또는 달걀 흰 척 슬라이드 (제 1), 뇌 섹션의 두 시리즈 하룻밤 실 온에서 건조를 허용 하 고 histochemically 시 냅 스 아연에 대 한 섹션을 처리.
    참고: 다른 시리즈는 비교를 위해, myelin ¹² 또는 ¹³ 수정된 프로토콜 사용 하 여 시 토 크롬 산화 효소 등 다른 표식에 대 한 처리 될 수 있습니다: 3% 자당, 0.015%, 시 토 크롬 C와 40 ° C에서 2-8 h에 대 한 품 어 0.015% 카 탈 라 제, 그리고 0.1 M 샌드위치에 0.02 %diaminobenzidine. Nissl 물질 시각 피 질 영역을 구별을 위한 조직학 표식으로 사용할 수 있습니다. 이러한 다른 조직학 얼룩 전통적인 젤라틴 코팅 슬라이드 대신 사용할 수 있습니다 그래서 뇌 섹션 달걀 흰 척된 슬라이드에 탑재 되어 필요 하지 않습니다.

4. 시 냅 스 아연 Histochemistry

1. 15 분에 대 한 절대 알코올에 슬라이드 마운트 섹션을 수정 하 고 1 헤에 대 한 실 온에서 완전히 건조 허용
< l나 > 짧게 10에 대 한 섹션을 담가 1% 젤라틴 솔루션 (제 1) s 하룻밤 실 온에서 건조 하 고.
참고: 최적의 결과 대 한 건조 하룻밤 섹션 수 있습니다. 더 나은 조직 얼룩이 생성 허용 건조 하룻밤 섹션.
2. 믹스 솔루션 단계에서 설명한 1.8 섹션 반작용 될 준비가 되 자 마자 함께.
   1. 슬라이드 유리 또는 플라스틱 쟁반에 나란히 정렬 하 고 슬라이드에 개발 솔루션을 붓는 하 여 섹션을 반응. 슬라이드 솔루션에 완전히 빠져들 되 고 어두운 공간으로 트레이 전송 하거나 확인 빛 상자 커버.
      참고: 플라스틱 쟁반 약 12 인치는 정확 하 게 18 슬라이드 맞는 8 인치 넓은 오래 사용할 수 있습니다. 200 mL 개발자 솔루션의 전체 볼륨은 완전히 슬라이드 잠수함, 그래서 올바른 볼륨은 사용 되도록 슬라이드 수 반응 수와 제조 법에 따라 조정할 충분 합니다. 플라스틱 또는 유리 트레이 금속 트레이 사용 하 여 반대로 사용은 권장 반응성 개발자 솔루션에서은 젖 고 철 사이 십자가 어느 정도 또는 다른 금속에 있는 금속 쟁반.
3. 섹션 마다 30 분을 시각적으로 검사 하 여 반응의 개발을 모니터링. 섹션은 일반적으로 완전 한 개발을 위한 120-180 분 필요.
4. 섹션 ( 그림 3a 참조) overstained 될 경우 2% 차별화 농부 ' s 솔루션 (9 부품 dH ₂ O 및 1 파트 2%에서 2% 나트륨 thiosulfate 칼륨 Ferricyanide dH ₂ O) 1-2 분에 대 한
   참고: 샘플 섹션을 제대로 묻은 그림 3b에 표시 됩니다.
5. 원하는 강도 달성 되 면 슬라이드를 제거 하 여 반응을 종료는 트레이 슬라이드 슬라이드 선반에 배치에서 섹션을 탑재.
6. 슬라이드 랙에 큰 유리 접시를 얼룩이 지 고 따뜻한 (40-50 ° C)에서 슬라이드 실행 제거 젤라틴 코트와 외부 실버 보증금 10 분 물 세척.
   참고: 수 섹션에서 미 끄 러에서 방지 하기 위해 슬라이드 랙 선동 하지 않도록 주의 하십시오. 섹션의 원하는 강도 충분 한 층 류 변화는 분명 하 고 섹션은 충분히 어두운 하지만 하지 기관사 ( 그림 4a 참조) 이루어집니다.
7. 허용, 실내 온도에 건조 하 고 다음 100%에서 탈수 슬라이드 EtOH (5 분), 크 실 렌 (5 분), 그리고 장착 매체와 커버 슬립에 분명. 또는 알코올의 상승 시리즈에서 슬라이드에 놓은 다음 탈수, 취소, 및 coverslip.
8. 이전 selenite 치료 부정적인 컨트롤 역할을 하지 않고 동물에서 사용 섹션. 이 섹션은 증폭 얼룩이 지 산출 해야 한다.

그림 3: 시 냅 스 아연 젊은 흰 족제비 뇌에 얼룩. 세미 접선 아연 스테인드 섹션을) overstained b) 젊은 흰 족제비 뇌에 understained의 photomicrographs. 영역 경계는 층 류 변이 부족으로 분별 하기 어렵다. 백색 질은 또한 무 겁 게 스테인드. Ssy Suprasylvian 피 질, WM 화이트 중요, 앞쪽, D 등. 눈금 막대 = 500 µ m (-b). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5. 영역 경계 구분 및 이미지 수집

면적 및 층 류 식별에 대 한 서로 다른 뇌 영역의

1. 사용 건축 술 기능.
   참고: 예를 들어 개발 쥐 retrosplenial 피 ¹⁴, 저자 밝혀 과도 모듈화 아연은 성인에 존재 하는 대뇌 피 질의 설명 하기 위해 활용 될 수에 대 한 무거운 얼룩 특징 이 종에서 개발 하는 동안 조직입니다. 다른 연구 ¹⁵, 저자 이러한 사단의 식별을 용이 하 게 짧은 꼬리 원숭이 편도 있는 다른 핵의 시 냅 스 아연 배포에 특이성을 공개 했다. 개발 및 성인 흰 족제비 뇌의 시각 피 질 영역 앞에서 설명한 ^{16 , 17 , 18}, 피 질에서의 건축 술 하위 되었습니다. 회색 다람쥐 설명된 ¹⁹ 했다입니다. 또한, 아연 histochemistry 이전 성인 원숭이 시각 피 질 ⁸, 개발 및 성인 고양이 시각 피 질 ⁵, 쥐 somatosensory 피 개발 지역 중 하기 위해 사용 되었습니다. ^{9 , 20}, 그리고 성인 마우스 somatosensory 피 ^{6 , 21}. 가능한 경우, 스테인드, 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 스테인드, 그리고 시 냅 스 아연 스테인드 뇌 섹션, 성인에서 영역 경계를 확인 하는 수 초에 얼룩 패턴을 비교 합니다. 세미 접선 섹션에서의 시 냅 스 아연에 대 한 스테인드 흰 족제비 시각 피 질, 시각 피 질 영역 영역 식별을 용이 하 게 하는 가운데 눈에 띄는 차이가 있습니다. 예를 들어 지역 17와 18 성인 흰 족제비의 공개는 시 냅 스 아연 얼룩 층 III에 높은 이며 V. 레이어 VI 얼룩 하지 덜 달아, 레이어 4 거의 아연 부족 하는 동안. 아연 레이어 IV 또는 어둡게 스테인드 밴드와 함께 지역 17와 18 대조에 얼룩의 눈 부족 콜로라도 4 스테인드 섹션 계층에서 발견. 그러나, 레이어 4 지역 공동에 17의 스테인드 섹션 III 및 V, 레이어와 날카로운 테두리 유지 하지만 레이어 영역 18에에서 4 강도 얼룩이 지는 미묘한 감소가 특징 이다 고 그것의 상한에서에서 발견 레이어 III 덜 구별할 수.
2. 낮은 전력 목표 명시 야 현미경을 사용 하 여 섹션을 검사 (2 배 또는 4 배 확대)과 관심 분야를 사진.
3. 향상 대비 고 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 photomicrographs의 밝기. 이미지 획득 대 광학 밀도 측정 어떤 식으로든에서 변경 되지 않을 합니다.

그림 4: 시 냅 스 아연 성인 흰 족제비 뇌에 얼룩이 지 구별 다른 시각 대뇌 피 질의 영역. 인접 한 세미 접선 섹션의 photomicrographs (한) 시 냅 스 아연 또는 (b) 시 토 크롬 산화 효소 (CO) 성인에 대 한 스테인드. 화살표 표시 영역 경계. Ssy Suprasylvian 피 질, 앞쪽, D 등. 눈금 막대 = 500 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

6. (선택 사항) Densitometry

참고: Densitometric 분석 관심의 영역에 섹션 스테인드 대표 아연의 광학 밀도 측정 하 여 뇌의 시 냅 스 아연의 분포를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 개발을 통해 시 냅 스 아연 수준에 잠재적인 변화를 추적 하는 데 유용.

1. 선택 사용 하 여 아연-얼룩진 섹션, 임의로 인수 photomicrographs의 관심 영역에서 (450 µ m 폭 열을 사용할 수 있습니다.) 적절 한 폭의 외피 열 (컬럼 photomicrographs)을 선택 합니다. 대뇌 피 질의 열이 백색 질을 pial 표면에서 모든 외피 층에 걸친 지역.
2. 관심의 각 지역에 여러 개의 다른 뇌 섹션에서 샘플 열에 대 한 적절 한 수를 선택 하십시오.
3. 대표 열의 샘플 이미지는 이미지 프로세싱 소프트웨어에 전송.
4. 사각형 선택 도구를 사용 하 여 전체 외피 열 하.
5. 반전 도구를 사용 하 여 명암 반전 이미지와 비슷한를 만드는 열의 사진 네거티브.
   참고: 이미지의 명암 반전 시 냅 스 아연 높은 수준에 대 한 높은 광학 밀도 값 및 낮은 시 냅 스 아연 수준에 대 한 낮은 광학 밀도 값에 수행 됩니다. 이것은 그림 5에서 본 것과 비슷한 플롯 프로 파일 그래프를 렌더링 하는 더 직관적인 방법으로.
6. 선 따라 픽셀 농도의 2 차원 그래프를 생성 하는 플롯 프로필 도구를 사용 하 여 이러한 이미지에서 광학 밀도 프로 파일을 생산.
7. 수직 프로 파일은 프로 파일 그래프 변환 하 고 플롯을 클릭을 사용 하 여 플롯 옵션 프로필 한 번 더.
   참고: 라인과 y 축을 따라 x 축 대표 거리 픽셀 강도를 나타냅니다. 따라서, 각 작 프로 파일 값 열의 너비에 걸쳐 각 깊이에 평균 그레이 스케일 값 반영.
스프레드시트에 텍스트 파일로
8. 오픈 플롯 프로필 값 정상화, 및 그래프 ( 그림 5 참조)으로 플롯.
   참고: 그것은 결과 서로 다른 반응 시간은 뿐만 아니라 다른 조직의 결과로 전체적인 착 강도에 변화에 의해 혼동 수 양적 측정의 비교에 대 한 시 냅 스 아연의 상대 밀도 사용 하는 것이 좋습니다. 변수.
9. Boxcar 평균 데이터를 원활 하 게 플롯 프로필 값을 수행 하 여 상대적인 아연 밀도 계산.
   참고: 이것은, 예를 들어 모든 연속 20 또는 30 픽셀을 평균 하 여 수행 (1 픽셀 = 2.5 µ m) 깊이, 그리고 다음 각 샘플에 대 한 최대 강도를 정상화. 따라서, 각 평균 플롯 프로필 값 그 깊이 (그레이 스케일 값 범위는 0부터 255)에서 평균 그레이 스케일 값을 반영합니다. 다른 정규화 방법 관심 분야에서 기본 백색 질을 포함 하는 샘플 영역에서 첫 번째 인수 백색 질 (WM) 광학 밀도 값으로 사용할 수 있습니다. 이상적으로, 평균 WM 값을 얻기 위해 가능한 스테인드으로 가볍게 여러 영역을 선택 합니다. 평균 광 밀도 값 다음 WM 정규화 값을 가져올 WM 평균값으로 나누어집니다.
10. 결정 양적 비교에 대 한 관심 영역의 특정 층에서 광학 밀도 값을 의미.
    참고: 예를 들어 레이어 IV 흰 족제비의 시각 피 질 영역에서에서 최소 광학 밀도 값 ± 5 픽셀 이상 스테인드 영역을 포괄 하 여 결정 됩니다.
11. ± 5 픽셀 평균 최대 값을 결정 하 여 어두운 스테인드 영역을 포괄 하 여 흰 족제비의 시각 피 질 영역의 supragranular 및 infragranular 레이어 광학 밀도 계산 값.
12. 확인 광학 밀도 값을 의미 하는 특정 레이어 내에서 얻을 수 있습니다.
    참고: 원래 photomicrographs 인접 한 공동 섹션을 비교 하 여 명암 반전 이미지에 이러한 계층의 한계를 확인 하는 것이 필수적 이다. 이 하나 인접 한 층에 침범 하지 않는 보장.

그림 5: 다른 시각 피 질에서 시 냅 스 아연의 층 류 분포 지역 성인 흰 족제비에. 성인에 해당 정규화 된 광학 밀도 프로필 모든 피 질 레이어를 통해 열 대표 photomicrographs. 성인 분야 17와 18의 4 층에서 시 냅 스 아연 낮은 밀도 프로 파일 플롯에 여 물통으로 표시 됩니다. 각 플롯 프로필에서 레이어 IV의 여 물통에 채워진된 타원 평균 최소 픽셀 휘도 값을 결정 하는 데 사용 하는 값을 나타냅니다. 눈금 막대 = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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결과

뇌 시 냅 스 아연에 대 한 섹션을 얼룩이 프로토콜에 관련 된 주요 단계는 그림 1의 순서도에 표시 됩니다. 프로토콜은 3 단계로 분할 될 수 있다: 1) 관류 및 조직 수집, 2) 조직 준비와 얼룩, 및 3) 아연 histochemistry. 간단히, 프로토콜의 첫 번째 단계 동물 마 취는 고 나트륨 selenite의 적절 한 복용량과 함께 IP를 주입. 기간 후에 충분 한 시간 (이상적으로 6...

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토론

현재 연구는 Danscher (1982) 방법¹⁰, 시 냅 스 아연 지역화를 감지 하 고 뇌에서 시각 수 있습니다 그것에 의하여의 수정된 된 버전에 따라 조직화 학적인 기술을 사용 합니다. 이 메서드는 기본적으로 아연 chelator 나트륨 selenite (나₂서구₃)를 가진 동물 (15 mg/kg)를 주입 하 여 작동 합니다. 주입, 따라는 selenite 두뇌에 여행 하 고 아연을 포함 하는 신경의 연 접 소포를 지?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euthasol (Euthanasia solution)	Henry Schein	710101
Sodium selenite	Sigma-Aldrich	214485
Ketamine (Ketaved)	Henry Schein	48858	100 mg/ml injectables
Xylazine (Anased)	Henry Schein	33198	100 mg/ml injectables
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Dilute to 4%
Gum arabic	Sigma-Aldrich	G9752-500G
Citric acid	Sigma-Aldrich	C1909
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Hydroquinone	Sigma-Aldrich	H9003
Silver lactate	Sigma-Aldrich	85210
Fish gelatine	Sigma-Aldrich	G7765
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C2506	(Type III, from equine heart)
Catalse	Sigma-Aldrich	C10
Sucrose	Domino
Xylene	Fisher Scientific	X5P-1GAL
Permount	Fisher Scientific	SP15-500
100% Ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used for dehydration prior to slide mounting
Coverslips	Brain Research Laboratories	#3660-1
Frosted unsubbed slides	Brain Research Laboratories	#3875-FR
Microtome	American Optical Company	860
Microscope	Olympus	BX-60
Adope Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images
ImageJ	Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/		For densometric measurements
Plastic tray	Any standard plastic tray may be used		to immerse slides in developer solution
Hot plate	Any standard hotplate may be used