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요약

여기, 우리 소설 간격 접속점 세포 통신 분석 결과 갭 정션 변조 화학 약물 발견 및 독성 평가의 높은 처리량 검열에 대 한 설계에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

간격 접속점 (GJs)는 인접 한 셀 사이의 1 kDa 보다 작은 분자의 유포를 허용 하는 세포 막 채널. 그들은 생리 적 및 병 적인 역할을가지고, 약물 발견과 독물학 분석에서 글리제 변조기를 식별 하기 위해 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험의 필요가 있다. 소설 요오드 화물-노랑 형광 단백질-간격 접속점 세포 통신 (난-YFP-GJIC) 분석 결과 수행이 필요 합니다. 그것은 안정적으로 노란 형광 성 단백질 (YFP) 변종, 그 형광은 요오드 화물, 또는 요오드 화물 운송업 자 SLC26A4 각각 침묵 민감하게 표현 하 설계는 기증자와 수락자 셀을 포함 하 여 세포 기반 분석 결과. 요오드 화물을 혼합된 문화는 두 종류의 세포에 추가 될 때 그들은 SLC26A4 전송 통해 기증자 세포를 입력 하 고 어디 그들이 YFP 형광 담금질 GJs 통해 인접 수락자 셀에 확산. YFP 형광 운동 모드에서 잘에 의해 잘 측정 된다. YFP 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. 분석 결과 신뢰성과 HTS.에 사용 될 만큼 빠른 인간의 glioma 세포, LN215 세포를 사용 하 여 YFP-GJIC 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

서문

간격 접속점 (GJs) 역할의 작은 분자의 확산을 허용 하도록 작성 채널 < 영양소, 대사 산물, 등 인접 한 셀 사이의 신호 분자 1 kDa. 접합 요소는 각 셀에 hemichannel 또는 connexon 포함 하 고 각 connexon 구성 6 connexins (Cxs)1. GJs 및 Cxs 글리제 억제제2,,34인 내는 다 환 방향족 탄화수소 (PAH) 등 발암 물질의 독성 분석 실험에 사용 되었습니다. 교란된 GJIC nongenotoxic 발암5,6와 연결 되었습니다. 잠재적인 치료 대상으로 GJ 참여 발작7,8, 심장 및 뇌 허 혈/reperfusion 상해9, 오 라10, 편두통에서에서 보호의 특정 하위에서 보고 되었습니다. 약물 유발 간 부상6,11, 그리고 상처 치유12. 높은 처리량 검열 (HTS) 분석 실험은 글리제 변조 화학 물질이 나 독성 분석 실험에 대 한 약물 발견에 대 한 항 체를 식별 하 고 글리제 활동의 소설 셀룰러 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 필요 합니다. HTS 분석 또한 글리제 변조기2,13,,1415의 구조 활동 관계를 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

일부 GJIC 분석 실험 염료 전송 또는 듀얼 패치 클램프 기술 포함. 루시퍼 노란색 채널 (LY)와 calcein acetoxymethyl 에스테 르 (calcein-오전) 염료 전송 분석 실험에 사용 되었습니다. 셀 정, microinjection, 로드, 흠집이 나 electroporation에 의해 도입에 융 화 되지 않습니다. 일단 셀 안에 서둘러 이웃 셀 통해 GJs에 확산 하 고 글리제 활동 LY 마이그레이션16의 범위에 의해 분석 키를 누릅니다. Calcein 오전 분석 실험은 일반적으로 photobleaching17,18후 갭 형광 복구를 포함 한다. Calcein 오전은 침으로 스며들 지 않는 calcein에 의해 변환 본질적인 esterase 셀 permeant 염료 이다. 분석 결과 관찰 된 레이저 photobleaching 다음에서 셀에 calcein 오전의 전송 하는 confocal 현미경을 필요 합니다. 기능 GJs 존재 하는 경우 인접 한 셀에 calcein 오전 photobleached 세포를 입력 하 고 형광 복구 됩니다. 글리제 활동은 photobleached 셀의 형광 복구의 범위에 의해 분석 됩니다. 염료 전송 분석 힘들고 시간이 걸리는 또는 낮은 감도 있다. 이중 패치 클램핑 접합 계수 측정 electrophysiological 방법입니다. 그것은 상대적으로 민감한, 오픈 GJs19; 수에 전도성의 직접적인 의존 그러나, 그것은 기술적으로 요구, 시간이 소모 및 비싼20. YFP-GJIC 분석 결과 HTS.에 사용 하기 위해 개발 되었다

그림 1 에서는 구성 요소와 베어링 H148Q 및 I152L 요오드 화물-민감한 YFP variant를 표현 하는 수락자 셀을 이용 하는-YFP GJIC 분석 결과의 단계 (YFPQL) 및 기증자 세포는 요오드 화물 운송업 자 (SLC26A4) 표현21 . 두 돌연변이 YFPQL에 의해 수행 요오드 화22형광의 냉각 허용 합니다. Iodides 공동 경작된 수락자와 기증자 세포;에 추가 됩니다. 그들은 수락자 셀을 입력 하지 마십시오 하지만 기증자 세포에 존재 SLC26A4 전송기에 의해 채택 됩니다. Iodides 기증자 세포에서 인접 한 수락자 세포 어디 그들이 YFPQL 형광 담금질로 작동 GJs 통해 확산 한다. 만약 GJs 폐쇄 또는 억제제에 의해 차단, 요오드 화물 수락자 셀 형광 담금질을 입력할 수 없습니다. YFPQL 냉각 속도 글리제 활동을 반영합니다. YFP GJIC 분석 결과 절차는 복잡 하지도 않고 시간이 소요. HTS와 호환 이며, 상대적으로 짧은 기간에 글리제 활동에 많은 화합물의 효과 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 수락자와 기증자 세포, 그리고 두 개의 균형된 소금 솔루션을 필요합니다. 아래에서 설명 하는 프로토콜의 주요 Cx는 Cx4321LN215 셀을 기반으로 합니다. LN215-YFPQL 수용 체 및 LN215-내가− 기증자 세포는 lentiviruses YFPQL 또는 SLC26A421,23표현으로 변환에 의해 생성 된.

프로토콜

1. YFPQL 와 SLC26A4는 lentiviruses 세대

  1. 100mm 문화 접시에 confluency 80 %HEK293T 인간 미 발달 신장 세포를 성장 한다. Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청, 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 보충은 HEK293T 아래에 언급 된 다른 셀을 유지 하기 위해 전체 프로토콜 사용 문화 매체 이다.
  2. 10 분에 대 한 각 잘을 멸 균 폴 리-L-리 신 (PLL) 솔루션의 0.005%의 2 개 mL를 추가 하 여 코트 6-잘 배양 배지 PLL 솔루션을 발음 하 고 표면 살 균 물 2 mL로 두 번 씻어.
  3. 워시는 HEK293T 셀 10 mL의 인산 염과 식 염 수 (PBS)를 버퍼링 문화 매체의 3 분 추가 5 mL에 대 한 37 ° C에서의 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL와 함께 각 100 mm 접시에 셀 monolayers를 치료 하 고 셀 resuspend.
  4. hemocytometer에 셀 문화 매체에 250, 000 셀/mL로 세포 현 탁 액의 밀도 조정 하 고 lysine 코팅 6 잘 플레이트의 각 문화 매체의 2 mL에 500000 셀을 추가. 습도 5 셀을 품 어 % CO2/95 %24 h에 대 한 37 ° C에서 공기와 다음 페니실린 이나 스 없이 DMEM 문화 매체를 바꿉니다.
  5. 1.5 mL 튜브에 20 µ L transfection 시 약의 혈 청 또는 항생제 없이 DMEM의 500 µ L로 희석. Pipetting으로 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 서 보자.
  6. 한편, 각 2 개의 1.5 mL 튜브에 DMEM의 250 µ L 플라스틱 하 고 1500 ng pLVX EIP YFPQL 또는 pLenti6P SLC26A4, psPAX2의 1225 ng, 375의 추가 각각 pMD2.G ng. 두 lentiviral 플라스 미드는 앞에서 설명한21있다. 각 플라스 미드 튜브를 희석된 transfection 시 약의 250 µ L을 추가 하 고 부드럽게 섞어 실 온에서 20 분 동안 품 어.
  7. 20 분 후 추가 transfection 시 약 및 플라스 미드 단지의 500 µ L 1.5 mL 튜브에 dropwise 단계 1.4 및 혼합에서 잘 각 문화 접시에 접시와 락 여. 37 ° c 12 h에 대 한 CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
  8. 2.5 mL 신선한 매체와 매체를 대체 하 고는 추가 48 h에 대 한 품 어. 다음 5 분 유지 조건된 매체 infectivity 유지 하기 위해 냉장 lentivirus를 포함 하는 얼음에 문화 접시를 놓습니다.
  9. 포함 하는 lentiviruses 미디어를 수확 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 전송. 3 분 4 ° C에서 3000 x g 에서 centrifuge 고 0.4 µ m에서 여과 하 여는 상쾌한에서 부동 HEK293T 셀 제거.
  10. 2 일 이내에 사용 하기 위해 4 ° C에서는 lentiviruses를 포함 하는 미디어를 저장 합니다. 나중에 사용 하기 위해 저장 −80 ° C에서 200 µ L aliquots

2. LN215-YFPQL 및 LN215의 생성-난 lentiviral 변환에 의해− 셀

  1. 80%로 100 mm 배양 배지에서 LN215 셀 성장 DMEM 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 U/mL 페니실린와 100 µ g/mL 스 위에서 설명한 대로 보충에 confluency.
    참고: 다른 셀 라인을 사용 하 여 YFP-GJIC 시험을 실시 하는 경우 적절 한 문화 매체를 사용 합니다. LN215 YFPQL및 LN215-- 나 셀 연세대 대학-산업 재단에 의해 제공 될 수 있습니다. 해당 저자에 문의 하십시오.
  2. 하루 전에 변환, 세척 셀 두 번 10 mL PBS의,와 함께 치료 0.25 %trypsin-EDTA 3 분 동안 37 ° C에서의 2 mL와 5 ml와 10 mL 혈 청 학적인 피 펫 문화 매체의 셀 Resuspend 고 50, 000 셀/ml 밀도 조정 합니다. 미디어의 400 µ L에 바이러스 컨트롤, YFPQL, 및 SLC26A4 세포 치료에 대 한 24-잘 문화 판의 각 잘 20000 셀을 추가 합니다.
  3. 후 37 ° C에 외피의 24 h, pLVX-EIP-YFPQL 또는 pLenti6P SLC26A4 lentivirus 및 polybrene 4 µ g/mL의 최종 농도에 보충 하는 신선한 문화 매체의 1:1 혼합물의 400 µ L와 문화 매체를 대체 하 여 두 개의 우물 transduce. 아니 바이러스 컨트롤에 대 한 문화 매체를 바꿉니다.
  4. 15 h 37 ° C에서 세포를 품 어, 매체를 포함 하는 lentiviruses 발음, 신선한 문화 매체를 추가 하 고 추가 72 h에 대 한 셀을 품 어.
    주의: 우물 사이 lentivirus의 오염 방지를 사용 하 여 새로운 팁 또는 pipets 각 잘 lentivirus를 포함 하는 문화 매체를 발음 하거나 신선한 성장 매체를 걸 때.
  5. 각 셀을 두 번 잘 0.5 mL PBS의,와 함께 치료 트립 신-EDTA의 300 µ L 3 분 Resuspend 문화 매체의 2 mL에 셀과 접시 2 µ g/mL puromycin 6-잘 문화 접시에 대 한 세척.
  6. 때까지 컨트롤의 모든 셀 잘 죽은 2 µ g/mL puromycin 포함 된 미디어에 셀 문화 (라운드 모양 또는 현미경에서 관찰 될 때 부동), 일반적으로 1 주일 소요. 문화 미디어 포함 puromycin 선택 기간 동안 매일 새로 고칩니다. 만약 LN215 YFPQL 또는 LN215-I- 문화 될 합칠 선택 완료 되기 전에, 100 mm 셀 접시와 선택 단계 2.5에서 계속 전송.

3. 분석 결과에 필요한 솔루션의 준비

  1. C-솔루션 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 포도 당 10 m m, 5mm KCl, 1 mM MgCl2, 및 1mm CaCl2)의 나-솔루션 (10 mM HEPES, 140 m NaI, 포도 당 10 m m, 5 m KCl, m 및 1 m CaCl2m m)의 500 mL 500 mL를 준비 합니다.
  2. 1 N NaOH와 7.4에 두 솔루션의 pH 조정, 저장을 위해 0.4 µ m에 filtrations에 의해 솔루션을 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 합니다. 사용 하기 전에 pH를 확인 합니다.

4. 도금 LN215 YFPQL , LN215-내가− 셀

  1. LN215-YFPQL 및 LN215 문화-나 시험에 필요한 인구를 도달 하 문화 매체에 별도로 100 mm 접시에− 셀. LN215-YFPQL 및 LN215-내가− 셀 40%와 80% confluency 100 mm 접시에는 각각 96 잘 접시 분석 결과 대 한 충분 한 있습니다.
  2. YFP GJIC 분석 결과 수행 하기 전에 1 일 각 100 m m 문화 접시 10 mL의 PBS로 세척. 각 플레이트의 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 취급 하 고 5 분 Resuspend 문화 매체와 전송 15 mL 원뿔 튜브 4 mL에 각 접시에 셀에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  3. 작은 셀 공의 3 분 삭제에 대 한 1000 x g 에서 원심 분리 하 여는 상쾌한 고 문화 매체의 5 mL으로 각 셀 펠 릿 resuspend. 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 약 20 배를 위아래로 pipetting으로 단일 세포로 어떤 세포 덩어리를 헤어.
  4. Hemocytometer, 셀을 계산 하 고 희석 LN215 YFPQL 80000 셀/mL 및 LN215의 셀 정지 수 있도록 문화 매체에 셀-나 160000 셀/mL에서− .
  5. 7 mL LN215 YFPQL 의 및 LN215의 7 mL를 혼합-내가 저수지에− 셀 정지. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 셀 96 잘 문화 판의 각 우물에 혼합물의 100 µ L를 추가 합니다.
    참고: 96-잘 셀 플레이트의 각 음에 혼합물의 100 µ L를 추가, 혼합된 세포 현 탁 액의 약 10 mL 필요 하다. 필요한 것 보다 더 많은 셀 정지 하 게 하는 것이 좋습니다.
  6. 셀을 품 어에 24 h에 대 한 37 ° C에서 5% CO2/95% 공기 습도. LN215-YFPQL 및 LN215-내가−세포 배양 분석 실험을 실시 하는 경우 100% 합칠 이어야 한다.

5. 실시-YFP GJIC 분석 결과

참고: 사용 20 x 확대와 함께 형광 현미경 및 확실 하 게 거기 96 잘 접시를 확인 하는 GFP 필터는 LN215 YFPQL 또는 LN215 SLC26A4 세포의 아무 덩어리와 셀 문화는 완전히 confluent 하 고 전에 잘 분산 분석 결과 실시합니다.

  1. 분석 결과, 일을 하기 전에 적어도 30 분은 미 판 설정 하 고 37 ° c.로 설정
  2. 300 µ L/s 흐름 속도에 70% 에탄올의 3 mL, 3 mL 증류수, 그리고-솔루션의 3 mL와 자동된 인젝터의 튜브를 세척.
  3. C-와 나-솔루션 물 목욕에서 37 ° C에 따뜻한.
    참고: 각 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 음에 대 한 필요에 따라 약 10 mL 각 솔루션의 각 분석 결과 대 한 필요 하다. 내가 솔루션의 추가 10 mL 못쓰게 각 접시 (20 mL의 총)에 대 한 필요 하 고 C-솔루션의 추가 25 mL 각 접시 (35 mL의 총) 세척 필요.
  4. 성장 매체를 발음 또는 반전; 빈 접시 잔여 중간에 밖으로 누릅니다.
    참고: 성장 매체에서 잔여 태아 둔감 한 혈 청 원인과 배경 형광 감소 분석 결과 품질에.
  5. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 저수지에서 각 음을 C 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다. C 솔루션을 발음 하거나 빈에 잔여 솔루션 밖으로 접시를 반전 합니다.
  6. 추가 50 µ L µ L C-솔루션, 2.5 m m 화학 주식 1 µ L ( 표 1참조) 또는 dimethylsulfoxide (DMSO)는 차량으로, 그리고 다음 50 µ L µ L C-솔루션을 다중 채널 피 펫과 각 영역.
    참고: 대부분 시 약 화학 라이브러리에 DMSO에 해산 하 고 최대 1% (v/v) 대부분 세포 기반 분석24에 허용 됩니다. DMSO는 물 보다 더 높은 밀도, DMSO에 용 해 시 약 분석 결과 솔루션의 농도 방해 문화 판 우물에 추가 될 때 바닥에 내려가 경향이 있다. 이 순서로 C 솔루션, DMSO, 시 약 및의-솔루션 50 µ L C 50 µ L을 추가 하 여 피할 수 있습니다. C 솔루션의 마지막 50 µ L 혼합입니다.
  7. 공기에서 5% CO2안에 37 ° C에서 세포를 품 어. 보육 시간을 수정할 수 있습니다, 하지만 10 분은 보통 이온 채널 변조기 행동에 대 한 충분 한.
  8. 외피, 동안 설정-솔루션을 각 영역 100 µ L 1에 삽입 microplate 리더 프로그램의 10에 대 한 형광을 측정 하 고 0.4 s 간격 s. 바닥에서 형광을 읽을 독자를 설정 합니다. 권장된 사출 속도 µ L/s 세트 485 nm 및 읽기 520에서 방출 흥분 파장의 135 nm.
    참고: microplate 리더 프로그램에 대 한 세부 설정은 다음과 같습니다.
    1. 관리 프로토콜 을 클릭 합니다.
    2. 새로 만들기 단추를 클릭 합니다. 독서에 형광 강도 측정 방법 섹션, 그리고 잘 모드 에서 선택 모드 섹션. 그런 다음 확인 버튼을 클릭 합니다. 새 탭이 표시 됩니다.
    3. 기본 매개 변수 메뉴에서 설정 여기 파장 485 nm 및 520에서 방출 nm. 하단 광섬유 바닥에서 형광을 읽을 선택 합니다. 설정된 측정 시작 될 시간 "0 s", "25", 섬광의 수 음, 당 수 및 "20", 될 간격 간격과 간격 시간을의 숫자 "0.4 s".
    4. 레이아웃 메뉴에서 읽을 수 판의 영역을 그립니다.
    5. 농도/볼륨/Shacking 메뉴에서 microplate 리더 135 µ L/s 사출 속도-솔루션을 각 영역 100 µ L를 주사를 설정 합니다.
      참고: 셀의 분리 될 수 있습니다 때문에 빠른 사출 속도를 피하십시오.
    6. 1 주입 시작 시간 설정 주입 시간 메뉴에 s. 그런 다음 측정 시작 버튼을 클릭 합니다.
  9. 부 화, 후 96 잘 접시 microplate 리더에 놓고 다시 측정 시작 버튼을 클릭 하 여 측정을 시작 합니다.

6입니다. GJIC 활동의 계산

  1. YFPQL 냉각 및23 GJIC 활동의 비율을 계산
    YFPQL 냉각 하는 (%) =figure-protocol-7294
    GJIC 활동 (%) =figure-protocol-7376
    참고: 원칙적으로, GJIC 활동 계산 해야 셀 수락자와 기증자 세포 우물 YFP 형광의 백분율의 차이에서 그리고 해당 수락자 셀만 우물. 그러나, LN215 YFPQL 셀 표시 무시할 YFP 냉각 요오드 화물에 의해 10 후 s, 우리가 갖지는 배경 YFP 냉각 계정으로 할 때 LN215 YFPQL 및 LN215를 사용 하 여 HTS-- 세포 나.

결과

29 96 잘 문화 접시-YFP GJIC 분석 결과 LN215 YFPQL LN215를 사용 하 여 2320 화학 소설 GJIC 변조기를 식별 하기 위해 화면을 사용 했다-난− 셀. 대표 한 접시와 함께 얻은 결과 그림 2에 표시 됩니다. 각 잘에서 YFP 형광의 비율 그림 2A 에서 선 그래프로 표시 되 고 각 잘에서 GJIC 활동의 비율 그?...

토론

YFP-GJIC 분석 결과 때문에, 급속 한, 강력 하 고 저렴 한 HTS에 대 한 사용할 수 있습니다. HTS 분석 결과 강력한 간주 됩니다 경우 Z'-요소 0.525이상입니다. 참조 장 그 외 여러분 HTS 분석25의 적합성을 평가 하는 데 사용 하는 통계 분석에 대 한. LN215 셀 사용 했다 Z'-요소 > 어떤 분석 결과 최적화 없이 0.5. 다른 세포 유형 분석 결과 및 그것의 Z에 사용 됩니다 '-요소는 <...

공개

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

감사의 말

이 연구는 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 교육부의 재정 지원에 의해 지원 되었다 (2011-0023701, 2016R1D1A1A02937397, 및 2018R1A6A1A03023718).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plateSPL30096
Calcium chloride (CaCl2)SigmaC5670I-solution
D-(+)-GlucoseSigmaG7021C-solution, I-solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)sigma276855
HEPESSigmaRES6003H-B7C-solution, I-solution
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-027transfection reagent
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2 6H2O)SigmaM2393C-solution
Microplate reader BMG LabTech POLARstar Omega 415-1618
pMD2.G Addgene#12259
PolybrenesigmaH9268
Poly-L-lysine solutionsigmaP4707
Potassium chloride (KCl)SigmaP5405C-solution, I-solution
psPAX2 Addgene #12260
Puromycin DihydrochloridesigmaP8833
Sodium chloride (NaCl)SigmaS5886C-solution, I-solution
Sodium hyroxide (NaOH)SigmaS2770
Sodium Iodide (NaI)Sigma383112I-solution

참고문헌

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