바이러스 감염시 m6A 및 m5C 에피레미테롬 탐험: HIV를 가진 예

요약

바이러스 감염에 있는 RNA 수정의 역할은 탐구하기 시작하고 새로운 바이러스성 호스트 상호 작용 기계장치를 강조할 수 있었습니다. 이 작업에서는 바이러스 감염의 맥락에서 ^m6A 및 ^m5C RNA 수정을 조사하는 파이프 라인을 제공합니다.

초록

생물학적 과정에 있는 RNA 수정의 역할은 지난 몇 년 동안 연구 결과의 증가 수의 초점이 되고 고 epitranscriptomics로 요즘 알려져 있습니다. 그 중에서도, N6-메틸라데로신(^m6A) 및 5-메틸시토신(^m5C) RNA 수정은 mRNA 분자에 기술되어 있고 세포 프로세스를 조절하는 역할을 할 수 있다. Epitranscriptomics는 따라서 바이러스 감염을 포함하여 어떤 화학 또는 생물학 에이전트에 노출에 의해 변경되거나 변조될 수 있기 때문에, 전사 분석 이외에 고려되어야 하는 규정의 새로운 층입니다.

여기서, 우리는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)로 감염되었거나 하지 않는 세포에서 ^m6A 및 ^m5C 마크의 관절 세포 및 바이러스 상피 적 경관의 분석을 동시에 할 수있는 워크플로우를 제시한다. HIV-감염 및 비감염 세포로부터의 mRNA 격리 및 단편화시, 우리는 RNA 면역 침전 기반 기술인 MeRIP-Seq, rna 면역 침전 기반 기술, ^m6A 마크및 BS-Seq, 양성환전환 기반 기술을 포함하는 RNA 단편을 농축하여 단일 핵티드 분해능에서 ^m5C 마크를 식별하는 두 가지 다른 절차를 사용했습니다. 메틸화 별 포획시, RNA 라이브러리는 고처리량 시퀀싱을 위해 준비됩니다. 또한 기초 발현 프로파일과 는 별개로 차별화된 메틸화(DM) 성적증명서를 식별하기 위해 전용 생물정보학 파이프라인을 개발했습니다.

전반적으로, 방법론은 동시에 다중 epitranscriptomic 마크의 탐구를 허용하고 바이러스 감염 또는 그밖 세포 동요에 DM 전사의 아틀라스를 제공합니다. 이 접근은 바이러스성 복제를 승진하거나 제한하는 세포 요인과 같은 새로운 플레이어 및 세포 반응의 새로운 기계장치를 식별할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다.

서문

RNA 분자가 변형될 수 있고, 150개 이상의 전사 후 수정이 현재까지 기술되었다는 것은 오래 알려져 있다¹. 그(것)들은 RNA 분자2의 pyrimidine 및 purine 고리의 거의 모든 위치에 화학 단, 주로 메틸 단의 ^{추가로 이루}어져 있습니다. 이러한 전사 후 수정은 이미 전사 RNA (tRNA) 및 리보소말 RNA (rRNA)에서 고도로 농축되는 것으로 나타났으며 최근에는 mRNA 분자에도 설명되어 있다.

차세대 시퀀싱(NGS)과 같은 신기술의 부상과 명확한 화학적 수정을 인식하는 특정 항체의 생산은 처음으로 전사 적 수준에서 특정 화학 적 수정의 위치 및 주파수에 대한 조사가 허용되었다. 이러한 발전은 RNA 수정의 더 나은 이해와 mRNA 분자^3,4에 대한 여러 수정의 ^{매핑으로 이어졌}습니다.

후성 유전학은 전사 성 규제에서 DNA와 히스톤 변형의 역할을 조사하는 동안, 유사한 방식으로 epitranscriptomics는 RNA 수정및 그들의 역할에 초점을 맞추고 있습니다. epitranscriptomic 수정의 조사는 다양한 세포 프로세스 (즉, RNA 접합, 수출, 안정성 및 번역)⁵를 조정할 수있는 새로운 규칙 메커니즘을 강조 할 수있는 새로운 기회를 제공합니다. 최근 연구에서 세포와 바이러스 성 ^RNAs6 모두에서 바이러스 감염에 많은 상피 수정을 발견 했다 따라서 큰 놀라운 일이 아니었다. 지금까지 조사된 바이러스에는 DNA와 RNA 바이러스가 모두 포함됩니다. 그 중에서도 HIV는 선구적인 예로 간주될 수 있습니다. 전부, 바이러스 감염의 맥락에서 RNA 메틸화의 발견은 바이러스성 발현 또는 복제의 아직 설명되지 않은 기계장치의 조사를 허용할 수 있습니다, 따라서 그(것)들을 통제하는 새로운 공구 및 표적을 제공⁷.

HIV 에피레미토믹스 분야에서 바이러스 성 성적 증명서의 수정은 널리 조사되었으며이 수정의 존재가 바이러스 복제8,9,10,11,12,13에 도움이되었음을 보여주었습니다. 현재까지 다양한 기술을 사용하여 전사 적 수준에서 에피레미토믹 마크를 검출할 수 있다. ^m6A 식별에 가장 많이 사용되는 기술은 MeRIP-Seq 및 miCLIP과 같은 면역 강수 기술에 의존합니다. MeRIP-Seq는 RNA 단편화에 의존하여 메틸화 잔류물을 포함하는 단편을 포착하는 반면, miCLIP은 RNA-항체 UV 교차 링크시 ^α-m6A 항체 특이적 시그니처 돌연변이의 생성을 기반으로 하므로 보다 정밀한 매핑을 허용합니다.

^m5C 변형의 검출은 ^m6A 검출(^m5C RIP)과 유사한 항체 기반 기술, 또는 비설피트 변환 또는 AZA-IP 또는 miCLIP에 의해 달성될 수 있다. Aza-IP와 ^m5C miCLIP 은 RNA 메틸화를 거치면서 RNA를 표적으로 하는 미끼로서 특정 메틸 트랜스퍼라아제를 사용한다. Aza-IP에서, 표적 세포는 5-azacytidine에 노출되어, 초기 RNA로 cytidine 아날로그 5-azacytidine 사이트의 임의로 소개의 결과로. miCLIP에서, NSun2 메틸 트랜스퍼라제는 C271A 돌연변이^14,15를 항구하기 위하여 유전자 변형됩니다.

이 작품에서는 HIV를 모델로 사용하여 감염된 세포의 ^m6A 및 ^m5C 변형의 이중 특성화에 중점을 둡니다. 방법론적 최적화시, 우리는 세포 및 바이러스 성 맥락에서 전사적 수준에서 ^m6A 및 ^m5C 상피 마크의 동시 탐사를 허용하는 메틸화 RNA 면역 침전(MeRIP)과 RNA 편황피화 변환(BS)을 결합한 워크플로우를 개발했습니다. 이 워크플로우는 바이러스 성 입자로부터 분리된 RNA뿐만 아니라 세포 RNA 추출물에 구현될 수 있다.

메틸화 RNA 면역전수량(MeRIP)¹⁶ 접근법은 전사-전체 수준에서 ^m6A의 조사를 허용하는 것이 잘 확립되고 ^m6A 특이적 항체의 배열이 현재까지 상용화되어 있다¹⁷. 이러한 방법은 ^m6A 특이적 항체를 이용한 ^m6A 함유 RNA 조각을 선택적으로 포획하는 것으로 구성된다. 이 기술의 2개의 주요 단점은 (i) RNA 단편의 크기에 크게 의존하고 따라서 메틸화 잔류물을 포함하는 대략적인 위치 및 영역을 제공하고, (ii) 분석을 수행하는 데 필요한 다량의 물질을 제공한다. 다음 최적화 된 프로토콜에서, 우리는 약 150 nt로 단편 크기를 표준화하고 폴리 A 선택 RNA의 10 μg에서 시작 물질의 양을 감소, 이는 현재 시작 물질의 권고 된 양, 폴리 A 선택 RNA의 단지 1 μg. 또한 페놀계 기술 또는 단백질아제 K를 이용한 보다 종래의 덜 특이적 용용 방법 대신 ^m6A 펩타이드와의 경쟁 접근법에 의한 경쟁 접근법에 의한 용출을 이용하여 특정 항체에 결합된 ^m6A RNA 단편의 회수 효율을 극대화했다. 그러나 이 RIP 기반 분석의 주요 제한은 정밀하게 변형된 A 뉴클레오티드의 식별을 허용하지 않는 최적이 아닌 해상도로 남아 있다.

^m5C 마크의 분석은 현재 두 가지 다른 접근법을 사용하여 수행될 수 있다: ^m5C 특이적 항체 및 RNA bisulfite 변환을 이용한 RIP 기반 방법. RIP는 메틸화 잔류물의 식별에 대한 제한된 해상도만 제공하므로 단일 뉴클레오티드 분해능을 제공할 수 있는 양성환 변환을 사용했습니다. 비설핏(BS)에 대한 RNA 노출은 시토신 탈약으로 이어져 사이토신 잔류물을 우라실로 변환한다. 따라서, RNA bisulfite 변환 반응 도중, 모든 비메틸화 된 사이토신은 탈액및 우라실로 변환되고, 사이토신의 위치 5에 메틸 군의 존재는 BS 유도 된 탈충을 방지하고 사이토신 잔류물을 보존하는 보호 효과가 있다. BS 기반 접근법은 단일 염기 해상도에서 ^m5C 변형 뉴클레오티드를 검출하고 각 성적증명서의 메틸화 주파수를 평가하여 ^m5C 수정 역학¹⁸에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나이 기술의 주요 제한은 메틸화 잔류물의 거짓 긍정 비율에 의존한다. 실제로, BS 변환은 접근 가능한 C 잔류물을 가진 단 하나 좌초 RNA에 효과적입니다. 그러나, 단단한 RNA 이차 구조의 존재는 N5C 위치를 가리고 BS 변환을 방해할 수 있고, U 잔류물으로 변환되지 않는 비메틸화 C 잔류물의 결과로, 따라서 거짓 긍정. 이 문제를 회피하고 거짓 긍정 률을 최소화하기 위해 3 차례의 디마튜션 및 비황피전환 주기¹⁹를 적용했습니다. 또한 비설피테 변환 효율의 추정을 가능하게 하는 2개의 컨트롤을 시료에 도입했습니다: 우리는 ERCC 시퀀싱 제어(비메틸화 표준화 및 시판 시퀀스)²⁰뿐만 아니라 폴리 A-A 고갈된 RNA를 한 손에 는 양황피전환율을 평가하고 RT-PCR에 의해 잘 알려진 것으로 알려진 C4의 존재를 검증하고, 잘 알려진 C4의 존재를 검증하기 위해 에 28S 리보소말 RNA 다른 한편으로는²¹.

바이러스학 분야에서, 차세대 시퀀싱과 정확한 생물 정보 분석과 이 두 가지 epitranscriptomic 조사 방법을 결합하면 ^m6A 및 ^m5C 역학의 심층 연구를 가능하게 합니다 (즉, 바이러스 감염 시 발생할 수 있는 RNA 수정 측두경 변경및 임상 사용에 대한 새로운 치료 관련 표적의 배열을 발견할 수 있음).

프로토콜

1. 세포 준비

참고: 세포 유형 및 RNA 함량에 따라 세포의 시작 수는 다를 수 있습니다.

1. 총 RNA의 200-500 μg 또는 다중 A 선택 RNA의 5-7 μg 사이에서 얻을 수 있는 충분한 세포가 있다. 예를 들어, 50 x ¹⁰⁶ SupT1 세포는 페놀 기반 시약을 추출할 때 총 RNA의 약 500 μg를 산출해야 하며, 따라서 테스트된 각 개별 조건에 대해 요구된다.
2. 실험 설계에 따라 필요한 수의 세포를 준비하여, 따라서 시험된 조건의 수에 따라서 (감염, 정점, 처리). 실험이 감염되지 않은 세포와 HIV 감염 세포를 24시간 감염 후 에서 얻는 것을 목표로 하는 경우 총 100 x ¹⁰⁶ 세포가 필요하며, 절반은 감염되지 않은 상태의 경우 절반, 감염된 상태의 절반은 필요합니다.

2. RNA 추출

1. 세포에서: 페놀 클로로폼을 가진 RNA 추출
   1. 각 조건에 대해, 원심 분리에 의해 세포 (예를 들어,50 x ¹⁰⁶)를 수집하고 상체를 폐기합니다.
   2. 각 50 x ¹⁰⁶ 셀 펠릿에 페놀 기반 시약 5mL을 추가하고 여러 번 위아래로 파이프를 사용하여 혼합합니다.
   3. 실온에서 5분 동안 배양하여 완전한 용해를 허용합니다. Lysed 세포는 -80 °C에 저장하거나 직접 처리 할 수 있습니다.
      참고: 필요한 경우, 세포는 1.5mL 튜브에서 튜브 당 10 x ¹⁰⁶ 세포의 알리쿼트로 분할되고 보다 편리한 저장을 위해 페놀 기반 시약 1mL로 용액될 수 있습니다.
   4. 클로로폼 1mL을 넣고 반전으로 섞습니다.
   5. 실온에서 3분 동안 배양하십시오.
   6. 2,000 x g 및 4 °C에서 15 분 동안 원심 분리기.
   7. 수성 상(상층)을 피펫하고 새로운 튜브로 이송합니다. 튜브를 45°로 기울여 수성 위상을 옮기고 조심스럽게 용액을 피펫으로 마무리하십시오.
      참고: 수성 상의 양은 샘플마다 다를 수 있지만 시료에 첨가된 클로로폼의 양 (즉, 1mL)에 가깝어야 합니다. 어떤 단계 또는 유기 층을 전송하지 마십시오! 위상 잠금 또는 위상 메이커 튜브를 사용하면 이 프로세스를 용이하게 할 수 있습니다.
   8. 수성 상에 100% 분자 급 이소프로판올의 0.5 mL를 추가합니다.
   9. RNA 강수량을 허용하기 위해 -80°C에서 1시간 동안 배양한다.
   10. 12,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리기를 사용하여 침전된 RNA를 펠릿합니다.
   11. 상체를 버리고 RNA 펠릿을 75% 분자 생물학 등급 에탄올의 1 mL에서 재중단한다. 소용돌이가 짧게.
   12. 7,500 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 하고 상체를 폐기하십시오.
   13. 펠릿을 15분 동안 공기 건조시합니다.
   14. RNase가 없는 물의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 새로운 튜브로 옮습니다.
   15. 빈 튜브를 추가로 20 μL의 물로 씻어 RNA 복구를 최대화하고 처음 20 μL 부피를 사용하여 풀을 하십시오.
   16. 분광계로 총 RNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가합니다.
2. 바이러스 성 입자에서: 컬럼 기반 바이러스 RNA 추출 키트와 RNA 추출
   참고: 페놀 기반 시약을 가진 바이러스 성 입자에서 RNA 추출은 낮은 품질의 바이러스 RNA와 낮은 품질의 라이브러리에서 발생합니다. 따라서 컬럼 기반 RNA 추출을 선호해야 한다. RNA 용출 및 회수를 위한 담체 RNA를 이용한 RNA 추출 키트는 이 절차에 적합하지 않으며 피해야 합니다. HIV RNA는 폴리-아데닐화되기 때문에, 추가 mRNA 절연 없이 직접 RNA 추출은 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 파이프라인에 들어가기에 충분합니다. 보편적으로 감염된 세포로부터의 바이러스 성 상피물의 일반적으로 1-2 mL은 전체 워크플로우를 수행하기에 충분한 RNA를 제공해야한다.
   1. 30mL의 용해 버퍼에 베타-메르카토에탄올 150 μL을 추가하여 버퍼를 준비합니다. 100% 에탄올의 96mL를 추가하여 바이러스 성 세척 버퍼를 재구성합니다.
   2. 바이러스가 함유된 수퍼나티와 원심분리기를 수집하여 세포 이물질을 펠릿하여 세포 RNA 오염을 최소화합니다.
   3. 15 mL 튜브에 바이러스 성 상류체의 1 mL을 전송합니다.
   4. 바이러스 RNA 버퍼 3mL을 바이러스 성 샘플 1 mL에 넣고 소용돌이에 섞습니다.
   5. 수집 튜브에 삽입된 컬럼에 700 μL의 샘플을 전송합니다.
   6. 상온에서 13,000 x g에서 2 분 동안 원심 분리기.
   7. 흐름을 삭제합니다.
   8. 전체 샘플이 처리될 때까지 3개의 이전 단계를 반복하여 모든 RNA가 실리카 계 매트릭스 컬럼상에 포획되었다.
   9. 열에 바이러스 세척 버퍼 500 μL을 추가합니다.
   10. 상온에서 10,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다.
   11. 열에 바이러스 세척 버퍼 200 μL을 추가합니다.
   12. 상온에서 10,000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다.
   13. 열을 빈 수집 튜브에 넣습니다.
   14. 원심분리기는 실온에서 10,000 x g에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 남은 세척 완충물질 오염 물질을 더 폐기합니다.
   15. 조심스럽게 1.5 mL 튜브로 컬럼을 전송합니다.
   16. 실온에서 30s에 대한 열 매트릭스와 원심 분리기의 중심에 직접 DNase / RNase가없는 물의 20 μL을 추가합니다.
   17. 열 매트릭스의 중앙에 직접 DNase/RNase가 없는 물의 10μL을 추가하고 원심분리기를 다시 30초 동안 추가로 추가합니다.
   18. 분광계로 총 RNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가합니다.
       참고: RNA 추출은 검색된 RNA의 품질이 높은 경우, RNA 무결성/품질 번호 > 9를 사용하여 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 총 RNA는 추가 처리될 때까지 -80°C에서 저장할 수 있습니다.

3. oligo (dT)₂₅와 폴리 A 선택에 의해 mRNA 절연

참고: 세포 추출물에서 고도로 메틸화된 리보소말 RNA의 존재로 인해, rRNA 고갈또는 폴리-A 양성 선택에 의해 폴리-A RNA를 우선적으로 분리하는 것이 좋습니다. 이 단계는 선택 사항이며 세포 RNA 샘플만 수행하여 더 높은 해상도로 시퀀싱 결과를 얻어야 합니다. 비 다중 아데닐라기 바이러스 RNA의 메틸화를 분석하는 경우, 폴리-A 선택보다는 rRNA 고갈을 선호하거나 결국 총 RNA에 대한 분석을 수행한다.

1. 폴리 A 캡처를위한 비드 준비
   1. 올리고 (dT)₂₅ 마그네틱 비즈 주식 바이알을 >30 s에 대한 소용돌이를 다시 중단합니다.
   2. 자기 구슬 200 μL을 1.5mL 튜브로 옮기습니다. 처리될 RNA 샘플의 총 수량에 따라 자기 구슬이 있는 튜브수를 준비한다.
      참고: 다이나비드 스톡 용액200μL을 가진 튜브 1개는 구슬 1mg에 해당하며 총 RNA 75μg 샘플을 수용할 수 있습니다.
   3. 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거합니다.
   4. 바인딩 버퍼 1mL(20m Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2mM EDTA)를 추가하고 소용돌이에 의해 재중단됩니다. 자석에 튜브를 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거합니다. 반복하다.
   5. 바인딩 버퍼의 100 μL에서 세척 된 자기 구슬을 다시 일시 중지합니다.
2. 총 RNA 제제
   1. 75 μg/100 μL에 해당하는 RNase 가 없는 물로 총 RNA를 0.75 μg/μL의 최종 농도로 희석시 희석시.
      참고: RNA가 농도가 낮은 경우 볼륨을 수정하지 않고 아래에 설명된 대로 진행합니다.
   2. Aliquot는 튜브 당 RNA 샘플 의 100 μL을 분배하여 다중 튜브에서 총 RNA를 인용합니다.
   3. 각 RNA 샘플에 결합 버퍼 100 μL을 추가합니다.
   4. 총 RNA를 65°C로 가열하여 2분 동안 가열하여 이차 구조를 방해합니다.
   5. 다음 단계로 나아갈 준비가 될 때까지 얼음 위에 즉시 놓습니다.
      참고: 인큐베이션 시간은 처리되는 시료의 수에 따라 달라질 수 있지만 RNA 분해를 피하기 위해 1h를 초과해서는 안 됩니다.
3. 폴리-A 선택
   1. 각 RNA 튜브(3.2단계에서)에 세척된 자기 구슬 100μL를 추가합니다(3.1단계에서).
   2. 위아래로 파이프를 돌리면 철저히 섞어서 실온에서 회전하는 휠에 15분 동안 바인딩을 허용합니다.
   3. 모든 튜브를 열고 자석에 1 분 동안 놓고 모든 상퍼를 조심스럽게 제거하십시오.
   4. 새로운 튜브에서 상체를 회수하고 폴리-A 최종 회복을 개선하기 위해 두 번째 RNA 포획(Step 3.3.14)을 위해 제쳐두십시오.
   5. 자석에서 튜브를 제거하고 세척 버퍼의 200 μL을 추가 (10m Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA). 조심스럽게 4 ~ 5 번 파이펫으로 섞는다.
   6. 튜브를 자석에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다.
   7. 세척 단계를 한 번 반복합니다(반복 단계 3.3.5 및 3.3.6).
   8. 비드에서 폴리-A RNA를 엘루트하기 위해 얼음 감기 10m Tris-HCl 20 μL을 추가합니다.
   9. 80 °C에서 2 분 동안 인큐베이션하십시오.
   10. 자석에 튜브를 놓고 폴리-A RNA를 함유한 상체를 새로운 RNase 가 없는 튜브로 신속하게 이송합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   11. 용출 단계(단계 3.3.8 내지 3.3.10)를 반복하여 수율을 늘립니다.
   12. 세탁 버퍼 200 μL로 동일한 구슬을 한 번 씻으시면 됩니다. 조심스럽게 4 ~ 5 번 파이펫으로 섞는다.
   13. 자석에 1분 동안 놓고 세척 버퍼를 버리십시오.
   14. 3.3.4 단계에서 유량을 구슬에 추가하고 구속력에서 용출까지의 절차를 반복합니다(3.3.2 ~ 3.10 단계). RNA용용유는 당분간 별도의 튜브에 보관하십시오.
       참고: 선택적으로, 컨트롤로 사용할 수 있으므로 새 튜브에서 3.3.4 단계와 동등한 상체를 다시 유지합니다. 절차의 끝에서, 에탄올 강수량 또는 선택의 컬럼 기반 방법 (즉, RNA 청소 및 농축기)에 의해 RNA를 정화하고 농축한다. 이 샘플은 다중 A-고갈 된 RNA 샘플에 대응하고 bisulfite 변환을위한 제어로 사용될 수있다 (단계 8.2.2).
   15. 용출된 RNA를 분광광계로 정량화하고 2 μL 알리쿼트를 유지하여 단편 분석기로 RNA 품질을 더욱 평가합니다.
       참고: 폴리-A RNA는 필요할 때까지 -80°C에 보관할 수 있다.

4. RNA 워크플로우

1. 세포 폴리-A RNA(mRNA) 및 바이러스 RNA 샘플을 각각의 상피 분석 파이프라인에 전념하는 2개의 알리쿼트로 나눕니다.
   (i) 세포 mRNA 5 μg 또는 MeRIP-Seq 및 입력 제어를 위한 바이러스 RNA 의 1 μg (단계 5 ~ 7, 및 단계 9로 이동).
   (ii) BS-Seq에 대한 바이러스 RNA의 세포 mRNA 또는 500 ng의 1 μg (8 단계 및 9단계로 이동).

5. RNA 단편화

참고: RNA 단편화는 RNA 단편화 시약으로 수행되며 MeRIP-Seq 및 제어 RNA 샘플을 위한 것입니다. 이것은 100-200 nt 사이의 조각을 얻기 위해 신중한 최적화가 필요한 매우 중요한 단계입니다.

1. mRNA의 총 부피를 mRNA/튜브의 18 μL로 0.2 mL PCR 튜브로 나눕니다.
   참고: 신속하게 작업할 수 있습니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 한 번에 8개 이상의 샘플로 작업하지 마십시오. 볼륨을 확장해도 재현 가능하고 균일한 조각화를 보장하지는 않습니다.
2. 70°C에서 열순환기를 데우겠습니다.
3. 각 PCR 튜브의 가장자리에 조각화 시약 2 μL을 추가합니다.
4. 튜브를 닫고 스핀 다운하십시오 (시약이 8 개의 튜브에 대해 동시에 RNA와 접촉하게됩니다).
5. 예열된 열순환기에서 70°C에서 15분 동안 시료를 배양한다.
6. 인큐베이션이 끝난 즉시 각 튜브에 2 μL의 정지 용액을 빠르게 추가합니다.
7. 스핀 다운하고 다음 단계로 진행할 준비가 될 때까지 얼음에 앉아 보자.
   참고: 인큐베이션 시간은 처리되는 시료의 수에 따라 달라질 수 있지만 RNA 분해를 피하기 위해 1h를 초과해서는 안 됩니다.
8. 모든 샘플에 대한 절차를 반복합니다(8개 이상의 알리쿼트가 있는 경우).
9. 튜브를 함께 풀링하고 RNA 청정 및 농축기 키트(6단계) 또는 맞춤형 컬럼 기반 키트로 RNA 정화를 진행하여 버퍼를 제거하고 물에 있는 깨끗한 단편화된 RNA를 회수합니다.

6. RNA 정화

참고: 이 단계는 에탄올 침전 또는 임의의 종류의 컬럼 기반 RNA 정제 및 농도 방법(즉, RNA 클린 및 농축기)에 의해 수행될 수 있다.

1. 엘ute 또는 DNase /RNase가없는 물의 총 부피 50-75 μL의 정제 된 RNA를 다시 중단합니다.
   참고: 열 기반 방법을 사용하는 경우 최대 복구를 위해 두 라운드의 용출을 강력하게 권장합니다.
2. 분광계로 정제된 단편화된 mRNA를 정량화하고 단편 분석기로 RNA 품질을 평가한다.
3. 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위한 입력 컨트롤로 조각화된 mRNA 100 ng를 유지합니다(9단계로 이동). 나머지 단편화된 mRNA(최소 2.5 μg)는 MeRIP(7.2단계로 이동)에 사용할 수 있습니다.

7. 메립

참고: 단편화된 mRNA의 최소 2.5μg은 각 면역침전수(IP)에 필요하며, 특정 항^m6A 항체(test condition)를 사용하거나 안티-IgG 항체(음성 제어)를 사용한다.

1. 면역 침전을위한 자기 비드 준비
   1. 각 시료에 대해, mRNA IP 완충제 5배(50m Tris-HCl pH 7.4, 750mMM NaCl, 0.5% Igepal CA-630, 뉴클레아스 프리 워터)의 800 μL을 3.2mL의 뉴클레아스 워터로 희석하여 새로운 원내 튜브에 1x IP 버퍼 4mL를 준비한다.
      참고: 적어도 2개의 반응이 필요합니다(테스트 1회 및 IgG 제어 1개).
   2. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   3. 원하는 IP 반응 수에 대해 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브의 적절한 수에 라벨을 부착하십시오.
      항m6A 항체용 n관(test).
      일반 마우스 IgG용 n 튜브(음수 제어)
   4. 반전 및 소용돌이에 의해 자기 구슬 (예를 들어, Magna ChIP 단백질 A/G)을 다시 중단합니다. 구슬 덩어리를 볼 수 없습니다.
   5. 계획된 각 반응에 대해, 자기 구슬의 25 μL을 마이크로 센심분리기 튜브로 옮기다.
   6. 사용된 구슬의 원래 부피(즉, 자기 비드의 25 μL 당 1배 IP 버퍼의 250 μL)에 대하여 10배 더 많은 1배 IP 버퍼(단계 7.1.1)를 추가합니다.
   7. 구슬을 여러 번 부드럽게 배관하여 혼합하여 완전한 재서스펜션을 합니다.
   8. 1 분 동안 자기 분리기에 튜브를 배치합니다.
   9. 체퍼를 제거하고 폐기하여 자기 구슬을 흡인하지 않도록 하십시오. 자석에서 튜브를 제거합니다.
   10. 세척 단계를 반복합니다(7.1.6~ 7.1.9단계).
   11. 구슬의 원래 부피의 25 μL 당 1배 IP 버퍼의 100 μL로 구슬을 재연한다.
   12. 자기 구슬의 원래 부피의 25 μL 당 항체의 5 μL (1 μg/μL)를 추가합니다.
       항m6A 항체(클론 17-3-4-1) [1 μg/μL]을 가진 n 관(test).
       일반 마우스 IgG (1 μg /μL)와 n 튜브 (음수 제어).
   13. 자기 구슬과 항체의 연상을 허용하기 위해 실온에서 30 분 동안 회전 휠에 배양.
   14. 1 분 동안 자기 분리기에 튜브를 배치합니다. 상부체를 폐기합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 1x IP 버퍼의 100 μL에서 항체 비드 혼합물을 다시 분리합니다.
2. RNA 면역 침전 (RIP)
   1. 다음과 같이 각 2.5 μg mRNA 샘플에 대해 RIP 반응 혼합물 500 μL을 준비하십시오: 단편화된 RNA의 100μL에서 2.5 μg (단계 6.12에서); 뉴클레아제 없는 물의 295 μL; 40 U/μL RNase 억제제의 5 μL; 및 5배 IP 버퍼의 100 μL.
   2. 각 항체 비드 혼합물에 RIP 반응 혼합물 500 μL을 추가합니다(7.1.14 단계에서~100 μL). 구슬을 완전히 재보페수 있도록 여러 번 부드럽게 파이펫을 섞는다. 얼음 위에 놓습니다.
   3. 4°C에서 2시간 동안 회전 휠에 모든 RIP 튜브를 배양합니다.
   4. 원심 분리는 MeRIP 반응을 간략하게 반응하여 캡과 튜브 측면에서 액체 방울을 회전시합니다. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓습니다.
   5. 새로운 원심분리기 튜브에서 상체를 옮기고 자기 구슬을 방해하지 않도록 주의한다.
      참고: 플로우루는 RIP 효율을 확인하기 위한 제어로 보관할 수 있습니다(7.3.9단계로 이동).
   6. 자석에서 튜브를 제거합니다. 차가운 1x IP 버퍼의 500 μL을 추가하여 구슬을 씻으세요. 구슬을 여러 번 부드럽게 배관하여 구슬을 완전히 재보페팅합니다.
   7. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓고 상체를 폐기합니다.
   8. 총 3개의 세척에 대해 세척 절차(단계 7.2.6-7.7.7)를 두 번 반복합니다.
   9. 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 용해로 진행합니다.
3. 용출
   1. 20mMm6A 용액을 10 mg의 N6-메틸라데로신, 5′모노포세산염 나트륨(^m6A)을 1.3mL의 뉴클레아제 없는 물로 용해시게 한다. 150 μL 알리코를 준비하고 -20 °C에 보관하십시오.
   2. 각 시료(테스트 및 제어):5배 IP 버퍼 45μL, 20mM ^m6A 75μL, 40U/μL RNase 억제제의 3.5 μL, 뉴클레아자유수의 101.5 μL 등 다음 성분을 혼합하여 225μL의 용출 버퍼를 준비한다.
   3. 용출 버퍼 100 μL(7.3.2 단계)을 구슬에 추가합니다(7.2.9 단계부터). 구슬을 완전히 재보페수 있도록 여러 번 부드럽게 파이펫을 섞는다.
   4. 4 °C에서 로커에 연속 흔들림으로 모든 튜브를 1 시간 동안 배양하십시오.
   5. RIP 반응을 원심분리하여 캡과 튜브 측면에서 액체 방울을 회전시합니다. 튜브를 자기 분리기위에 1분 동안 놓습니다.
   6. 용출된 RNA 단편을 포함하는 상체를 새로운 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 이송한다. 비드를 흡인하지 않도록 주의하십시오.
   7. 용출 단계(7.3.3 ~ 7.3.6)를 다시 100 μL의 용출 버퍼를 추가하고, 4°C에서 1h를 배양하고, 자기 분리 후 용출을 수집한다.
   8. 동일한 샘플에서 모든 용출을 결합합니다(총 용출 부피는 200 μL이어야 합니다).
   9. 에탄올 강수량 또는 열 기반 선택 방법(즉, RNA 클린 및 농축기)에 의해 용출된 RNA 및 유량(7.2.5단계으로부터 선택 사항)을 정화합니다.
   10. 고감도 검출 키트를 사용하여 단편 분석기를 사용하여 RNA 수량 및 유량 및 용출 된 샘플을 평가합니다. RNA의 품질이 만족하는 경우, 라이브러리 준비 및 높은 처리량 시퀀싱(단계 9)을 진행한다.
       참고: MeRIP에서 검색된 RNA의 양은 매우 낮으며, 정량화를 보장하기 위해 반드시 고감도 검출 키트가 필요합니다. 생체 분석기를 사용할 수 없는 경우, 도서관 준비에 맹목적으로 진행할 수 있다.

8. RNA 비설피테 변환

1. 제어 및 시약 준비
   1. ERCC 믹스 스파이크 인 제어: mRNA의 500 ng에 희석되지 않은 ERCC 믹스의 0.5 μL을 추가하는 것이 좋습니다 제조업체의 지시에 따라 ERCC 믹스를 추가합니다. 이 제어는 비설피트 변환의 효율성을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   2. 스파이크 폴리-A 고갈 RNA (단계로부터 3.3.14) 비율 1/1000 (즉, mRNA의 500 ng에 대한 폴리 A 고갈 RNA의 500 pg). 이 샘플은 리보소말 RNA에서 농축되어 따라서 28S rRNA, 양성 조절을 포함해야 한다.
      참고: 총 RNA는 또한 다중 A 고갈 RNA 대신 양성 대조군으로 사용될 수 있습니다.
   3. RNA 메틸화 키트(예: Zymo EZ)로 비설피트 변환을 수행합니다.
   4. RNA 세척 버퍼: 사용하기 전에 RNA 세척 버퍼 농축물의 12mL에 100% 에탄올(또는 95% 에탄올의 52mL)의 48mL을 추가합니다.
2. 비설피트 변환
   참고: 비설피테 변환은 아래에 명시된 대로 제조업체의 절차에 따라 상업적으로 이용 가능한 RNA bisulfite 변환 키트로 수행되었다.
   1. 0.2 mL PCR 튜브에서 1000 ng의 mRNA (또는 300 에서 1000 ng 사이)를 추가하십시오. 스파이크 인 컨트롤 추가 : ERCC 믹스의 1 μL (단계 8.1.1) 및 폴리 A 고갈 RNA의 1000 pg (단계 8.1.2). DNase/RNase가 없는 물로 최대 20μL의 완전한 부피를 완성합니다.
   2. RNA 변환 시약 130μL을 각 20 μL RNA 샘플에 추가합니다.
   3. 위아래로 파이프를 사용하여 샘플을 혼합합니다.
   4. 튜브의 캡이나 측면에 물방울이 없는지 확인하기 위해 잠시 회전하십시오.
   5. PCR 튜브를 열 사이클러에 놓고 다음 단계를 수행하십시오: 5분 동안 70°C에서 의 분해; 45 분 동안 54 °C에서 변환; 총 3사이클에 대한 반복적인 거부 및 변환 단계; 그런 다음 4 °C에서 무기한 으로 유지하십시오.
      참고: 3주기의 데마산및 비황피트 변환은 시료의 완전한 비황피트 변환을 보장합니다. 샘플은 -80°C에 저장하거나 직접 처리할 수 있습니다.
   6. 열 내 탈황을 진행합니다. 컬럼을 빈 수집 튜브에 넣고 컬럼에 RNA 바인딩 버퍼 250 μL을 추가합니다.
   7. RNA 바인딩 버퍼를 포함하는 컬럼에 샘플(~150 μL)을 로드하고 위아래로 배관하여 혼합합니다.
   8. 매컬의 샘플 RNA 결합 버퍼 혼합물에 95-100% 에탄올의 400 μL을 추가합니다. 캡을 닫고 열을 여러 번 반전하여 즉시 섞습니다.
   9. 30 초용 최고 속도 (≥ 10,000 x g)의 원심 분리기. 흐름을 삭제합니다.
   10. RNA 워시 버퍼 200μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 최고 속도로 30초간 추가합니다.
   11. RNA 황전 버퍼 200μL을 컬럼에 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 30 초 전속력의 원심분리기. 흐름을 삭제합니다.
   12. RNA 워시 버퍼 400μL을 컬럼에 넣고 원심분리기를 최고 속도로 30초간 추가합니다. RNA 세척 버퍼의 추가 400 μL로 세척 단계를 반복합니다. 흐름을 삭제합니다.
   13. 2 분 동안 최고 속도로 비워진 컬렉션 튜브의 컬럼을 원심 분리합니다. 컬럼을 RNase 가 없는 튜브로 옮기십시오.
   14. 단열 매트릭스에 직접 DNase/RNase가 없는 물의 ≥ 10μL을 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 30 초전속의 원심분리기.
       참고: 우리는 보통 20 μL의 부피로 엘ute. 용출 된 RNA는 즉시 사용하거나 최대 3 개월 동안 -20 °C에서 저장할 수 있습니다. 장기 보관을 위해 -80°C로 유지하십시오.
   15. RNA 품질 및 수량의 단편 분석기 평가를 위해 2.5 μL을 꺼내 서고 준비 및 고처리량 시퀀싱(단계 9)을 진행한다.
   16. 효율의 편유피 변환 제어를 위해 변환 된 RNA의 4 μL을 가져 가라 (단계 8.3).
3. RT-PCR에 의한 비설피트 변환 제어
   참고: 이 단계는 시퀀싱을 진행하기 전에 비설피트 변환이 성공했습니다. 호모 사피엔스의 28S 리보소말 RNA는 RNA 메틸화 분석에 대한 양성 대조군으로 사용될 것이며, C 잔류물은 4447(GenBank 가입 #NR_003287)로 100% 메틸화된 것으로 설명되고 있다.
   프라이머 시퀀스:
   H 28SF 프라이머: 5'-GGGGTTAYGATTTTTTTTTTGGG-3'
   H 28SR 프라이머: 5'-CCAACTCACRTTCTATTAATAATAATAAC-3'
   1. 대용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 역전사(RT) 반응 믹스를 준비한다. 얼음에 키트 구성 요소를 해동하고 다음과 같이 얼음에 RT 마스터 믹스를 준비 :
      비술피테의 4 μL 변환 RNA (단계 8.2.14에서):
      10xRT 버퍼의 2 μL
      0.8 μL 의 25배 dNTP 믹스 [100mMM]
      10x RT 랜덤 프라이머 의 2 μL
      멀티스크리브 역전사 1μL
      RNase 억제제 의 1 μL
      뉴클레아제 프리 _H2O의 9.2 μL
      참고: 각 RT 반응에는 0.2mL PCR 튜브의 20 μL 최종 부피가 포함되어야 합니다.
   2. 다음 RT 프로그램과 함께 열 사이클러에 튜브를 넣어 : 10 분 동안 25 °C; 120 분 동안 37 °C; 5 분 동안 85 °C; 그런 다음 4 °C에서 무기한.
   3. PCR 교정 효소를 사용하여 28S rRNA를 증폭시키기 위해 PCR 반응을 준비합니다. 키트 구성 요소를 얼음, 부드럽게 소용돌이 및 간략하게 원심분리기에 적어 보냅니다. 다음과 같이 얼음이나 얼음 냉철 판 홀더에 PCR 마스터 믹스를 준비하십시오.
      10 μM H 28SF 프라이머의 0.6 μL
      10 μM H 28SF 프라이머의 0.6 μL
      템플릿 cDNA의 6.5 μL
      DNA 폴리머라제 마스터 믹스의 22.5 μL
      참고: 각 PCR 반응에는 0.2mL PCR 튜브의 20 μL 최종 부피가 포함되어야 합니다.
   4. 다음 PCR 프로그램과 함께 열 사이클러에 튜브를 넣어 : 5 분 동안 95 °C에서 초기 분해; 45사이클의 데나포화(15s용 95°C), 아닐링(30초동안 57°C), 신장(15초동안 72°C), 72°C에서 10분 동안 최종 신장, 그리고 4°C에서 무기한 으로 유지한다.
   5. 2% 아가로즈 젤에 반응의 10 μL을 실행합니다. 예상 대역 크기는 130 - 200 bp입니다.
4. PCR 제품의 시퀀싱
   1. 효소및 dNTP 잔류물을 제거하고 증폭된 DNA를 DNase/RNase 가 없는 물의 최소 20μL에서 염화한 DNA를 예테하는 것이 선택되는 컬럼 기반 방법으로 PCR 제품을 정화합니다.
   2. 정제된 DNA를 분광광계로 정량화합니다.
   3. 시퀀싱 반응
      1. PCR 제품/염기서열 분석 반응의 40 ng를 사용합니다.
      2. H 28SF 및 H 28SR 프라이머를 사용 하 여 양방향으로 서열.
      3. 알려진 비변환 시퀀스와 서열을 정렬 (28S 리보소말 N5 (RNA28SN5). 위치 C4447에서 C 잔류물의 존재 여부를 확인하고 다른 곳에서 C 대신 T 잔류물의 경우.

9. 라이브러리 준비 및 고처리량 시퀀싱

1. elute-Prime-Fragment 단계에서 프로토콜을 시작하고 제조업체 지침을 따르기 위해 mRNA 키트(예: 일루미나 TruSeq Stranded)를 사용하여 시퀀싱을 위한 라이브러리를 준비합니다.
   1. 그러나, 입력 RNA-Seq 및 MeRIP-Seq 샘플의 경우, 샘플을 80°C에서 2분 동안 배양하여 전성기에만 만주하지만 더 이상 단편화하지는 않는다.
2. 일루미나 플랫폼을 사용하여 시퀀싱을 수행합니다. 시퀀싱 반응은 최소 100nt 길이로 단일 또는 페어링 된 끝 중 하나 또는 쌍의 종결환경 및 실험 설계에 따라 수행 될 수 있습니다.

10. 생물정보학 분석

1. ^m6A 데이터 처리
   1. ^FASTQC24를 실행하여 ^m6A의 판독 품질을 평가하고 시퀀싱에서 FASTQ 파일을 입력합니다.
   2. ^Atropos25를 실행하여 판독에서 저품질 엔드 및 어댑터 시퀀스를 다듬습니다. Atropos를 실행에서 다음 매개 변수를 설정합니다.
      1. AGATCGGAAGAG, CTCTTCCGATCT, AACACTCTTTCCCT, AGATCGGAAGAGCG, AGGGAAAGAGTGTT, CGCTCTTCCGATCT : 다음과 같은 어댑터 시퀀스를 제거합니다.
      2. 제조업체(https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html)가 지정한 저품질 단자를 트리밍하기 위해 5.
      3. 트리밍 후 다음 최소 읽기 길이를 사용합니다: 25 개의 기본 쌍.
   3. GRh38 인간 게놈 및 HIV [통합 선형 pNL4-3Env-GFP] 참조를 FASTA 형식으로 병합합니다.
   4. 합병된 참조를 ^HISAT226으로 인덱싱합니다.
   5. 트리밍된 읽기에서 HISAT2를 실행하여 인덱싱된 참조에 정렬합니다. 기본 HISAT 매개 변수를 사용합니다.
   6. 정렬된 읽기를 SAMtools27로 정렬하고 인덱싱^합니다.
   7. SAMtools 통계 및 Qualimap ²²⁸을 ^{실행하여 시}퀀스 라이브러리의 정렬 후 품질 검사를 위해 실행합니다.
   8. 선택적으로 ^multiQC29를 사용하면 이전 단계의 품질 측정값을 수집하고 요약합니다.
   9. HIV 게놈은 5'LTR 및 3'LTR에서 동종 634 bp 서열을 가지고 있습니다: SAMtools를 가진 해당 3' LTR 지구에 5'LTR에서 멀티 매핑 판독을 재조정합니다.
   10. ^m6A 피크를 식별하려면 피크 호출 소프트웨어 MACS230(v 2.1.2)을 실행합니다. MACS2 실행 매개변수를 신중하게 선택하여, 최고 호출이 유전자 발현 수준에 의해 영향을 받을 수 있고, 짧은 엑소온이 피크로 잘못 호출될 수 있기 때문에 RNA-Seq 데이터에 대한 올바른 기능을 보장하기 위해. 따라서 MACS2에서 DNA 기반 데이터에 일상적으로 적용하지 않고 입력 신호를 ^m6A 신호에서 빼야 합니다. MACS2의 '콜피크' 하위 명령에 다음 매개 변수를 적용합니다.
       - 유지 DUP 자동 (중복 읽기로 MACS2 동작을 제어, '자동'MACS는 p 값 컷오프로 1e-5를 사용하여 이소미 분포를 기반으로 정확히 동일한 위치에서 읽기의 최대 수를 계산 할 수 있습니다)
       -g 2.7e9(bp의 인간 게놈 크기)
       -q 0.01 (최소 FDR 컷오프가 중요한 피크를 호출)
       - 노모델 (ChIP-Seq 실험에 맞게 조정된 변속 모델 구축 우회)
       -slocal 0
       -llocal 0 (이 및 이전 매개 변수를 0으로 설정하면 MACS2가 매끄럽지 않고 직접 빼고 ^m6A 읽기에서 입력이 읽습니다).
       -내전 100(bp의 조각의 평균 길이)
       -B
   11. MACS2의 하위 명령을 호출하는 차동 피크를 실행, 'bdgdiff' 감염된 대 비 감염 된 샘플을 비교합니다. 'bdgdiff'는 이전 단계에서 'callpeak'에 의해 생성된 bedGraph 파일을 입력하는 것으로 수행됩니다. 각 시간 지점에 대해, 감염된 대 비감염 시료를 'bdgdiff'로 비교하여 ^m6A 신호로부터 각각의 입력 신호를 빼고 추가 매개변수를 제공합니다: -g 60-l 120.
2. ^m5C 데이터 처리
   1. ^Cutadapt31을 실행하여 다음 매개 변수를 사용하여 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스를 다듬습니다.
      어댑터 "아가트CG가가카카크GTGTCTGAAC"
      - 최소 길이 =25.
   2. 시퀀싱 프로토콜이 역방향 가닥에서 읽기를 생성하므로 seqkit32를 사용하여 트리밍된 읽기를 역으로 보완합니다.
   3. FastQC를 실행하여 판독 품질을 검사합니다.
   4. FASTA 형식으로 GRh38 인간 게놈 및 HIV[통합 선형 pNL4-3Env-GFP] 참조를 병합합니다.
   5. 메란TK 패키지³³에서 응용 프로그램 meRanGh와 병합 된 참조를 색인.
   6. 다음과 같은 매개 변수와 meRanGh와 정렬 :
      - UN을 가능하게 하는 매핑되지 않은 읽기는 출력 파일에 기록될 수 있습니다.
      -MM 을 사용하면 멀티 매핑된 읽기를 출력 파일에 기록할 수 있습니다.
      -베드그래프출력용 bg
      -mbgc 10 필터 커버리지에 의해 보고 된 지역 (적어도 10 판독 범위)
   7. HIV 게놈은 5'LTR 및 3'LTR에서 동종 634 bp 서열을 가지고 있습니다: 멀티 매핑 판독을 5' LTR에서 SAMtools를 사용한 해당 3' LTR 영역으로 재정렬됩니다.
   8. meRanTK에서 제공하는 meRanCall 도구를 통해 메틸화 호출을 실행합니다.
      -rl = 126, 읽기 길이
      -ei = 0.1, 메틸화 율 p-값 계산에 대한 오차 간격
      -cr = 0.99, 예상 전환
   9. 각 샘플의 크기 요인을 추정하기 위해 MeRanTK의 유틸리티 estimateSizeFactors.pl 실행합니다. 크기 요소는 다음 단계에서 매개 변수로 사용됩니다.
   10. 실행 MeRanCompare 비감염 대 시간 점 12, 24 및 36h에 걸쳐 감염의 차동 메틸화 분석을 위해 비교합니다. 다음 매개 변수가 적용됩니다: 이전 단계의 보고 및 크기 요인에 대한 최소 임계값으로 .01의 중요도 값이 적용됩니다.

결과

이 워크플로우는 HIV 감염의 맥락에서 ^m6A 및 ^m5C 메틸화의 역할을 조사하는 데 유용합니다. 이를 위해, 우리는 우리가 HIV에 감염하거나 치료되지 않은 떠나는 CD4+ T 세포주 모형 (SupT1)를 사용했습니다. 우리는 조건당 5천만 개의 세포로 워크플로우를 시작하고 RNA 질 수가 10 (그림 1A-B)로 총 RNA의 평균 500 μg를 얻었습니다. 폴리-A 선택에 따라 조건당 mRNA의 10 에서 12 μg 사이를 검색합니다 (총 RNA의 약 2 %를 나타냅니다)(그림 1B). 이 시점에서, 우리는 MeRIP-Seq 파이프라인에 대한 폴리 A 선택 RNA 5 μg와 BS-Seq 파이프라인에 대한 1 μg를 사용했습니다. HIV RNA는 폴리-아덴레이트되기 때문에 추가 조치가 필요하지 않으며 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 절차를 직접 적용할 수 있습니다.

그림 1: 다운스트림 응용 을 위한 RNA 준비. A) 동시 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 파이프라인에 대한 RNA 준비 및 분포를 묘사하는 워크플로우. 채워진 모든 육각형 형상은 ^m6A(녹색) 또는 ^m5C(분홍색)와 같은 RNA 변형 유형을 나타낸다. 실험을 수행하는 데 필요한 RNA 물질의 양이 표시됩니다. B) 총 RNA 추출(상부 패널) 및 다중A 선택(하부 패널)에 대한 예상 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)을 기재하는 대표적인 결과. 샘플은 특정 MeRIP-Seq 및 BS-Seq 절차를 입력하기 전에 RNA 품질을 평가하기 위해 표준 감도 키트를 사용하여 단편 분석기에 로드되었습니다. RQN: RNA 품질 번호; nt: 뉴클레오티드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MeRIP-Seq 파이프라인은 RNA 분자를 따라 ^m6A 변형을 조사할 수 있는 RNA 면역 침전 기반 기술입니다. 이를 위해, RNA는 면역 침전 및 포획을 위해 자기 구슬에 결합된 ^m6A 특이적 항체로 먼저 단편화되고 그 후 배양된다. MeRIP 농축 RNA 단편및 손길이 닿지 않은 (입력) 분획은 ^m6A 변형 RNA 영역과 따라서 ^m6A 메틸화 된 전사체를 식별하기 위해 시퀀스되고 비교된다 (도 2A). 기술의 해상도는 RNA 단편화의 효율성에 의존한다. 실제로, 짧은 조각은 ^m6A 잔류물의 보다 정확한 국소화를 가능하게 합니다. 여기서, 세포 다중-A 선택 된 RNA 및 바이러스 RNA는 100-150 nt의 RNA 단편을 얻기 위해 20 μL 최종 부피에서 15 분 동안 RNA 단편화 버퍼로 이온 기반 단편화를 실시하였다. mRNA의 5 μg로 시작하여, 우리는 90 %의 회복 속도에 해당하는 단편화된 RNA의 4.5 μg를 회수했습니다 (그림 2B). 우리는 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 직접 실시입력 제어로 단편화, 정제 된 RNA의 100 ng를 사용했다. 나머지 RNA(~4.4 μg)는 MeRIP-Seq 파이프라인에 따라 처리되었으며, 이는 항체가 있는 단편화된 RNA의 배양으로 시작하여 항^m6A 특이적 항체또는 반대로 IgG 항체를 대조군으로 결합하였다. ^m6A 특이적 RIP(MeRIP)의 단편화된 RNA의 2.5 μg는 라이브러리 준비 및 시퀀싱(도 2B)을 받은 ^m6A 농축 물질의 약 15ng을 회수할 수 있었습니다. 예상대로 안티-IgG 제어를 가진 RIP는 추가 분석을 허용할 충분한 RNA를 산출하지 못했습니다(도 2B).

그림 2: MeRIP-Seq 파이프라인. A) MeRIP-Seq 워크플로우 및 입력 제어의 회로도 표현. 폴리-A 선택에 따라 시료는 120-150nt 조각으로 단편화되었고, 시퀀싱(100 ng, 입력 제어)을 직접 실시하거나, 항체 를 이용한 RNA 면역침전(2.5 μg, RIP)에 사용되는 경우, 시퀀싱 전에 음의 대조군으로 사용하였다. B) 단편화(상부 패널) 및 RIP(하부 패널, MeRIP: 왼쪽, IgG 제어: 오른쪽)에 기대되는 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)을 나타내는 대표적인 결과. 샘플은 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 추가 처리하기 전에 RNA 품질과 농도를 평가하기 위해 단편 분석기에 로드되었습니다. 단편화된 RNA 분석은 RNA 표준 감도 키트를 사용하여 수행되었으며 면역 침전 RNA는 고감도 키트를 사용했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

BS-Seq 파이프라인은 뉴클레오티드 해상도에서 ^m5C RNA 변형을 탐색할 수 있으며 ^m5C-메틸화 된 성적 증명서의 식별으로 이어집니다. 비황피티 전환시 메틸화된 사이토신은 우라실로 변환되고 메틸화된 사이토신은 변하지 않습니다(그림 3A). 비설피테 변환 절차 (예: 고온 및 낮은 pH)의 열악한 조건으로 인해 변환된 mRNA는 고도로 저하(그림 3B)이지만, 이는 도서관 준비 및 시퀀싱을 방해하지 않습니다. Bisulfite 변환은 단 하나 좌초 RNA에 만 효율적이므로 잠재적으로 이차 이중 좌초 RNA 구조물에 의해 방해될 수 있습니다. C-U 변환의 효율성을 평가하기 위해 두 개의 컨트롤을 도입했습니다. 긍정적인 대조군으로서, 우리는 28S ^rRNA23의 위치 C4447에서 고도로 메틸화 된 사이토신의 이전에 설명 된 존재를 이용했다. RT-PCR 증폭 및 메틸화 부위를 둘러싼 200 bp 단편의 시퀀싱에 따라 우리는 모든 사이토신이 우라실로 성공적으로 변환되어 DNA 서열에서 티미딘으로 나타나는 것을 관찰할 수 있었으며, 그 결과, 위치 4447의 시토신을 제외하고는 DNA 서열에서 티미딘으로 나타났다. 비설피테 전환율에 대한 대조군으로서, 우리는 시판되는 합성 ERCC RNA 서열을 사용했습니다. 이 혼합물은 알려진, 비 메틸화 및 다중 아데니레이션 RNA 서열의 풀로 구성되며, 다양한 이차 구조 및 길이를 가진다. 라이브러리 준비 및 시퀀싱시, 우리는 모든 ERCC 서열 및 각 샘플에서 총 C 잔류물 중 변환 된 C의 수를 계산하여 수행 할 수있는 전환율을 계산하기 위해 이러한 ERCC 서열에 초점을 맞추었다. 전환율은 99.5%로 비설피트 전환 반응의 효율과 성공을 확인하였다(그림 3D).

그림 3: BS-Seq 파이프라인. A) BS-Seq 워크플로우의 회로도 표현. 폴리A 선택에 따라 샘플은 비황핏에 노출되어, 비메틸화 C 잔류물의 C변환(탈약으로 인한)이 발생합니다. 대조적으로, 메틸화 된 C 잔류물 (^m5C)는 양성환 처리에 의해 영향을 받지 않으며 변경되지 않습니다. B) 표준 감도 키트를 가진 단편 분석기에 대한 분석 시 비설피테 변환 RNA 분포 프로파일(크기 및 양)의 대표적인 결과. C) 28S rRNA에서 위치 4447에서 100% 메틸화 C를 둘러싼 지역의 RT-PCR 앰플리콘의 대표적인 시퀀싱 결과를 나타내는 일렉트로페로그램(파란색으로 강조). 대조적으로, 기준 서열의 C 잔류물은 양성환 변환 성공으로 인한 앰플리콘 서열에서 T 잔류물으로 확인되었다. D) HIV 감염 및 비감염 된 세포에서 ERCC 스파이크 인 서열의 분석에 의한 C-U 전환율의 평가. 평균 전환율은 99.5%입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

^M6A 농축 시료, 비설피테 변환된 샘플 및 입력 제어는 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 생물정보 분석(그림 4)을 위해 추가로 처리됩니다. 실험 설계 및 생물학적 질문에 따르면 다중 생체 정보 분석을 적용할 수 있습니다. 원칙의 증거로, 우리는 HIV 감염에 유도 된 차별화 메틸화 성적 증명서의 식별에 초점을 맞춘 하나의 잠재적 인 응용 프로그램 (즉, 차동 메틸화 분석)에서 대표적인 결과를 보여줍니다. 간단히, 우리는 바이러스 성 수명 주기 동안 RNA 메틸화의 역할을 더 이해하기 위해 유전자 발현 수준과 독립적으로 유전자 발현 수준과 독립적으로 ^m6A 또는 ^m5C 메틸화 수준을 조사했습니다. 유전자 발현 정상화시, 우리는 ZNF469 전사체가 감염 상태에 따라 ^m6A-메틸화되었다는 것을 확인했으며, 실제로 이 성적증명서는 HIV 감염 시 여러 메틸화 피크를 표시하는 동안 비감염된 세포에서 메틸화되지 않았다는 것을 확인했습니다(그림 5A). ^m5C에 유사한 차동 메틸화 분석은 PHLPP1 성적 증명서가 HIV 상태에서 더 자주 메틸화되는 경향이 있는 몇몇 메틸화 된 잔류물을 포함하는 것으로 나타났습니다 (도 5B). 이 맥락에서, 두 분석은 HIV 감염이 세포 에피레마에 영향을 미친다는 것을 건의합니다.

그림 4: ^m6A 및 ^m5C 데이터 분석을 위한 생물학적 워크플로우의 회로도 표현.

그림 5: 감염 시 차분하게 메틸화된 성적증명서의 예. A) HIV 감염(green) 및 비감염(grey) 세포에서 ZNF459 전사체의 ^m6A 메틸화를 보여주는 대표적인 결과. 피크 강도(입력 식 빼기 시)는 x축을 따라 염색체의 y축 및 위치에 표시됩니다. 차동 메틸화 분석은 ZFN469 성적 증명서가 HIV 감염시 과구화된다는 것을 보여줍니다. B) HIV 감염(상부 차선) 및 비감염(하부 차선) 세포에서 ^m5C 메틸화 유전자의 대표적인 결과. 각 막대의 높이는 뉴클레오티드당 읽기 수를 나타내며 커버리지 평가를 허용합니다. 각 C 잔류물은 빨간색으로 표시되고 메틸화 된 C의 비율이 파란색으로 표시됩니다. 정확한 메틸화 율(%)은 각 C 잔류물 위에 보고됩니다. 화살표는 IGV 뷰어를 사용하여 통계적으로 유의한 분화 된 C. 샘플을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

바이러스 감염에 있는 RNA 수정의 역할은 아직도 크게 알려지지 않습니다. 바이러스 감염의 맥락에서 epitranscriptomic 수정의 역할의 더 나은 이해는 새로운 항 바이러스 치료 목표에 대 한 탐구에 기여할 수 있습니다.

이 작품에서는 감염된 세포의 ^m6A 및 ^m5C 에피레모니오크를 조사할 수 있는 완벽한 워크플로우를 제공합니다. 생물학적 질문에 따라 폴리A 선택 RNA를 시동 재료로 사용하는 것이 좋습니다. 비록 선택적이지만, 파이프라인은 총 RNA와 함께 사용될 수 있기 때문에 rRNA뿐만 아니라 작은 RNA가 고도로 수정되고 메틸화 잔류물의 중요한 수를 포함하는 것을 명심하는 것이 중요합니다. 이로 인해 의미 있는 시퀀싱 데이터의 품질과 수량이 감소할 수 있습니다.

그러나, 연구의 초점이 비다성 RNA인 경우, RNA 추출 단계는 작은 RNA(컬럼 계 RNA 추출의 경우)를 폐기하지 않도록 하고, 파이프라인에 진입하기 위해 다중A 선택보다는 리보솜 고갈 기술을 특권하기 위해 적응되어야 한다.

고품질 RNA, 올바른 단편화 및 적절한 ^m6A 농축 및 BS 변환 RNA 품질을 보장하기 위해 라이브러리 준비를 위해 RNA 품질을 변환하여 단편 분석기 또는 생체 분석기를 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 이 장비가 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다. 대안으로, RNA의 품질, mRNA 및 단편화된 RNA의 크기는 또한 아가로즈 젤에 시각화에 의해 평가될 수 있었습니다. 대안적으로, 라이브러리 제제는 RNA 수량에 대한 이전의 평가 없이 수행될 수 있다.

우리는 ^m6A 에피레마레토믹 풍경을 탐구하기 위해 항체 기반의 MeRIP-Seq16 기술을 사용했습니다. 이 기술은 RNA 면역 침전을 기반으로 하고 성공적입니다; 그러나 일부 단계는 신중한 최적화가 필요하며 중요할 수 있습니다. ^m6A 메틸화는 주로 합의 서열 RRA*CH 내에서 발생하도록 기술되었지만, 이 모티프는 mRNA 분자를 따라 매우 빈번하며 메틸화 부위의 정확한 식별을 허용하지 않는다. 따라서 RIP 기반 해상도를 개선하기 위해, 작은 RNA 단편을 생성, 재현 가능하고 일관된 RNA 단편화를 달성하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서는 최적화된 절차를 권장하며 실험 환경에서 재현 가능하고 일관된 결과를 제공하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 조각화 단계는 특정 샘플 피쳐에 따라 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

최근에는 ^m6A 직접 시퀀싱을 허용하는 새로운 기술이 설명되었다. 그것은 ^m6A RNA 수정을 접는 것에 대한 응답으로 독특한 RT 서명을 나타내는 특정 역 전사 변이체의 사용을 기반으로^합니다24. 이 기술은 신중한 최적화시 MeRIP-Seq(초기 재료의 양을 줄이고 더 높은 해상도를 허용)에 직면한 주요 한계를 우회할 수 있습니다. ^m5C 수정을 탐구하기 위해 우리는 뉴클레오티드 해상도에서 수정된 C 잔류물을 검출하기 위해 비설피테 변환 기술을 사용하기로 결정했습니다. RNA 이차 구조의 존재로 인한 거짓 양성률을 줄이기 위해 ERCC 스파이크인 컨트롤의 사용으로 인해 3주기의 내성/양성환 변환을 수행하고 양성환 전환율 성능을 더욱 조절했습니다. 이 기술에 연결된 한계 의 한개는 bisulfite 변환이 아주 가혹하고 데니션/bisulfite 변환의 3 주기는 몇몇 RNA를 저하시키고 그러므로 해결책을 감소시킬 수 있었다는 것입니다. 그러나 설정에서 데이터 집합의 품질을 높이기 위해 잠재적으로 약간 낮은 해상도에 정착하기로 결정했습니다.

이러한 최적화 및 제어 덕분에 바이러스 감염, 숙주 병원체 상호 작용 또는 특정 치료에 대한 노출의 맥락에서 상피 지형 및 변경 사항을 조사하기 위해 악용 할 수있는 신뢰할 수있는 사운드 워크플로우를 제공 할 수있었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuPrime Pfx SuperMix	Invitrogen	12344-040
anti-m6A antibody _Clone 17-3-4-1	Millipore	MABE1006
Chloroform	Merck	67-66-3
ERCC	Invitrogen	4456740
EZ RNA Methylation Kit	Zymo Research	EZR5001
Fragment analyzer RNA Kit - HS RNA Kit	Agilent	DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA Kit	Agilent	DNF-471-0500
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
Illumina TruSeq Stranded mRNA	Illumina	20020594
Magnetic Beads A/G Blend	Merck	16-663
N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt (m6A)	Sigma Aldrich	M2780-10MG
Normal Mouse IgG	Merk	12371
Oligo(dT)25	Life Technologies	61005,
PCRapace	Stratec	1020220300
Quick RNA Viral Kit	Zymo Research	1034
RNA Clean & Concentrator	Zymo Research	R1015
RNA Fragmentation Reagent	Ambion	AM8740
RNase Inhibitor	Ambion	AM2684
Trizol	TRIzol Reagent	15596026