Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

요약

여기에서 우리는 수질 신장 세포 유형의 표현을 개선하고 효소 조직 해리로 인한 유전자 발현 아티팩트를 방지하는 냉동 마우스 신장에서 고품질 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

신장은 물, 전해질 및 산-염기 항상성과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 신장의 생리적 기능은 장기의 피질 수질 축을 가로질러 복잡한 구조로 배열된 여러 세포 유형에 의해 실행됩니다. 단세포 전사체학의 최근 발전은 신장 생리학 및 질병에서 세포 유형별 유전자 발현에 대한 이해를 가속화했습니다. 그러나 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)에 자주 사용되는 효소 기반 조직 해리 프로토콜은 대부분 신선한(보관되지 않은) 조직을 필요로 하고, 전사 스트레스 반응을 도입하며, 신장 피질의 풍부한 세포 유형 선택을 선호하여 수질 세포의 과소 대표성을 초래합니다.

여기에서는 이러한 문제를 피하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 냉동 신장 조직으로부터 4°C에서 핵을 분리하는 것을 기반으로 합니다. 핵은 피질, 외부 수질 및 내부 수질로 구성된 마우스 신장의 중앙 조각에서 분리됩니다. 이것은 데이터가 전체 피질 수질 축을 충분히 풍부하게 나타내도록 수질 세포의 이점을 위해 전체 신장 샘플에 대한 전형적인 피질 세포의 과대 표현을 줄입니다. 이 프로토콜은 간단하고 신속하며 적응력이 뛰어나며 신장 연구에서 단일 핵 전사체학의 표준화를 향한 단계를 제공합니다.

서문

신장은 매우 복잡한 조직 구조를 나타냅니다. 이들은 피질수질축을 따라 기능적으로나 해부학적으로 구별되는 부분으로 구성되며 세포외액 부피, 전해질 균형 또는 산-염기 항상성 조절과 같은 생물학적 기능을 매개한다¹.

단세포 전사체학의 발전은 복잡한 조직의 심층적인 특성 분석을 가능하게 하고 신장 생리학, 발달 및 질병 ^2,3,4에서 분절 및 세포 유형별 유전자 발현에 대한 이해를 가속화했습니다.

그러나 scRNA-seq에 자주 사용되는 효소 기반 해리 프로토콜은 몇 가지 단점과 제약을 나타냅니다. 프로토콜에 따라 전사 스트레스 반응과 조직 해리 편향을 생성하기 쉬운 피질 세포 유형 ^5,6. 배아 신장에 저온 활성 프로테아제를 사용하는 프로토콜은 스트레스 관련 전사 변화를 완화할 수 있지만, 피질 세포에 대한 해리 편향을 극복하지 못하고 다른 종류의 병든 신장 조직에 쉽게 적응하지 못할 수 있습니다⁷. 또한, 단세포 접근법은 냉동 조직 샘플과 쉽게 호환되지 않아 대부분 보관되지 않은 신선한 조직으로 적용을 제한하여 조직 수집을 제한 요인으로 만듭니다⁶.

단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)은 이러한 한계를 우회할 수 있다 ^8,9. 여기에서 우리는 냉동 성인 마우스 신장 조직의 중앙 조각에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다(그림 1)¹⁰. 우리의 프로토콜은 간단하며 강력한 지역 조직 변화를 포함하지 않는 실험 모델을 위해 다양한 신장 세포 유형의 균형 잡힌 표현으로 RNA 시퀀싱 라이브러리를 얻기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다. 후자의 경우, 우리의 프로토콜은 전체 신장으로도 수행 될 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 동물 복지법 (TierSchG) 및 동물 복지 실험 동물 규정 (TierSchVersV)에 따라 수행되었으며 지방 당국과 우리 기관의 동물 복지 담당관 (MDC)의 승인을 받았습니다.

1. 조직 준비

1. 얻을 각 신장에 대해 웰당 2mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)가 들어 있는 6웰 플레이트를 준비합니다. 웰 및 신장당 2mL의 RNA 안정화 용액을 포함하는 6-웰 플레이트를 준비합니다. 두 접시를 얼음으로 미리 식히십시오.
2. 3-6개월 된 수컷 C57BL/6 마우스를 안락사시킵니다. 마우스를 해부 트레이에 놓고 사지를 고정하고 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오.
3. 집게와 가위를 사용하여 흉곽까지 복부를 엽니다. 장과 다른 장기를 옆으로 들어 올리고 가위로 요관, 신장 동맥 및 정맥을 조심스럽게 절단하여 신장을 제거합니다. 미리 준비된 얼음처럼 차가운 1x PBS로 신장을 세척하고 모든 흰색 조직이 제거될 때까지 신장 근막과 신장에서 남아 있는 지방을 제거합니다(그림 2A).
4. 차가운 해부 판에 신장을 놓고 날카로운 메스 또는 면도날을 사용하여 1-2mm의 중간 조각을 얻습니다. 조직 조각에 전체 피질 수질 축이 포함되어 있는지 확인하십시오(그림 2B). 미세 해부 가위와 집게를 사용하여 중앙 부분의 측면에서 피질을 조심스럽게 다듬습니다. 해부된 조직 조각 내에서 피질, 외부 수질 및 내부 수질의 세 부분이 명확하게 보여야 합니다(그림 2C).
   참고: 슬라이스는 효과적인 조직 용해를 위한 충분한 완충액을 확보하고 cDNA 라이브러리에서 주변 배경 RNA를 최소화하기 위해 두께 2mm 또는 무게 20mg을 초과해서는 안 됩니다. 주변 RNA는 단일 핵과 관련이 없기 때문에 서열 용량을 낭비합니다.
5. 신장 조각을 미리 준비된 RNA 안정화 용액으로 옮기고 RNA 분해를 피하기 위해 4°C에서 24시간 동안 배양합니다. 24시간 후, RNA 안정화 용액을 제거하고, 추가 사용이 될 때까지 -80°C에서 조직을 보관한다. 티슈 페이퍼로 여분의 용액을 조심스럽게 제거하십시오.

2. 핵 분리

1. 청소 및 준비 단계
   1. 70% 에탄올 및 RNase 오염 제거 용액으로 벤치탑과 피펫을 세척합니다.
   2. 바닥이 둥근 2mL 조직 그라인더 튜브와 일치하는 유봉 A와 B를 RNase 오염 제거 용액으로 세척한 다음 70% 에탄올과 RNase가 없는 물(샘플당 1개의 그라인더 튜브 및 유봉 세트)을 세척합니다. 완전히 말리십시오.
   3. 원심분리기를 4°C로 예식합니다.
   4. 얼음 위의 각 샘플에 대해 3개의 15mL 수집 튜브, 1.5mL 수집 튜브, 5mL 형광 활성화 세포 분류(FACS) 수집 튜브 및 건식 분쇄기 튜브에 라벨을 부착하고 사전 냉각합니다.
2. 버퍼 준비
   1. 리보뉴클레오시드-바나딜 착물 원액을 제조자의 지시에 따라 녹색-검정색 투명 용액으로 재구성될 때까지 65°C로 예열한다. ¹¹
   2. 표 1A에 기재된 바와 같이 4% 소혈청알부민(BSA)을 함유하는 1x PBS를 제조한다. 추가적으로, 0.04% BSA를 갖는 1x PBS를 제조한다(표 1B). 0.2μm 계면활성제가 없는 아세트산 셀룰로오스(SFCA) 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 두 용액을 모두 여과하고 추가 사용이 있을 때까지 얼음 위에 두십시오.
   3. Nuclei Lysis Buffer 1(NLB1, 표 1C)을 준비합니다. 15mL 튜브에 Nuclei Lysis Buffer 2(NLB2, 표 1D)용 EZ 용해 완충액 4mL와 Nuclei Suspension Buffer(NSB, 표 1E)용 0.04% BSA/PBS 2mL를 추가합니다. RNase 억제제 용액을 프로토콜에 아래 표시된 대로 사용하기 직전에 NLB2 및 NSB에 추가합니다. 더 사용할 때까지 얼음을 보관하십시오.
   4. 10% 수크로오스로 EZ 용해 완충액을 준비한다(Sucrose Gradient Buffer, 표 1F). 잘 섞고 0.2μm SFCA 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 새로운 15mL 튜브에 버퍼를 여과합니다. 더 사용할 때까지 얼음을 보관하십시오.
3. 조직 균질화 및 세포 용해
   참고: RNA 분해를 최소화하기 위해 모든 단계는 얼음 위에서 수행됩니다. 그라인더 튜브, 페트리 접시 및 모든 버퍼는 사전 냉각되어야 합니다. 모든 재현탁 단계는 핵 현탁액을 조심스럽게 피펫팅하여 수행됩니다. 전단력과 핵 손상을 피하기 위해 샘플을 소용돌이치지 마십시오.
   1. 얼어 붙은 신장 조각을 가져 와서 1mL의 NLB1이 들어있는 얼음 위의 60mm 폴리스티렌 페트리 접시에 옮깁니다.
   2. 면도날이나 메스를 사용하여 조직을 완전히 다집니다(그림 3A).
   3. 1mL 피펫 팁의 끝을 잘라내고 다진 티슈와 완충액을 분쇄기 튜브에 옮깁니다. 모든 티슈 조각을 옮겨야 합니다. 필요한 경우 완충액으로 페트리 접시를 5-10 번 씻으십시오.
   4. 그라인더 튜브에서 유봉 A를 위아래로 25배 천천히 움직여 얼음 위에서 현탁액을 균질화합니다. 빠른 움직임으로 인한 기포를 피하십시오(그림 3B).
   5. 미리 냉각된 15mL 수집 튜브에서 100μm 여과기를 통해 균질액을 통과시키고 또 다른 1mL의 NLB1로 필터를 세척합니다.
   6. 차가운 EZ 핵 용해 완충액으로 그라인더 튜브를 세척하고 완충액을 폐기합니다.
   7. 균질액을 그라인더 튜브로 다시 옮기고 그라인더 튜브에서 유봉 B를 위아래로 15배 천천히 움직여 얼음 위에서 현탁액을 균질화합니다. 빠른 움직임으로 인한 기포를 피하십시오(그림 3C).
   8. 균질액을 미리 냉각된 15mL 수집 튜브로 옮깁니다. 그라인더 튜브를 다른 2mL의 NLB1로 세척하고 모든 조직 조각을 수집 튜브로 옮깁니다. 균질액(총 부피 4mL)을 얼음 위에서 5분 동안 배양하여 세포를 용해시킵니다.
4. 핵 정화
   1. 균질액을 40μm 여과기를 통해 미리 냉각된 15mL 수집 튜브에 통과시킵니다. 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 4°C에서 500 x g 로 5분 동안 수집 튜브를 회전시킵니다. 그 동안 RNase 억제제 용액을 NLB2에 첨가합니다(표 1D).
   2. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거하십시오. 펠릿을 4mL의 NLB2에 조심스럽게 재현탁합니다.
   3. Sucrose Gradient Buffer 1mL 쿠션으로 현탁액을 조심스럽게 밑에 깔았습니다. 스윙 버킷 로터가 있는 원심분리기에서 4°C에서 5분 동안 500 x g 로 원심분리합니다. 그 동안 RNase 억제제 용액을 NSB에 첨가합니다(표 1E).
   4. 원심분리 후 원심분리기에서 수집 튜브를 부드럽게 제거하고 수집 튜브를 취급할 때 두 층이 방해받지 않도록 주의하십시오. 두 층 사이에 세포 파편이 보입니다. 파편부터 시작하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 핵 펠릿을 방해하지 않고 나머지 상층액을 제거하고 NSB 1mL에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다.
      참고: 재현탁 부피는 분리에 사용된 조직의 양과 마지막 원심분리 단계 후에 얻은 펠릿 크기에 따라 다릅니다. 부피는 예상되는 핵 수에 맞게 조정해야 할 수도 있습니다.
   5. 균질액을 20μm 스트레이너를 통해 미리 냉각된 5mL FACS 수집 튜브에 통과시킵니다.

3. 핵 분류

1. NSB mL당 20μL의 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 FACS 수집 튜브의 균질액에 최종 농도 2μM로 추가하고 조심스럽게 혼합합니다. 얼음에서 5분 동안 배양합니다.
2. 20μL의 4% BSA/1x PBS로 미리 냉각된 1.5mL 수집 튜브를 준비하고 0.5μL RNase 억제제 용액을 1U/μL의 최종 농도에 추가합니다. 즉시 분류를 진행하십시오.
3. 세포 분류기를 사용하여 핵을 정렬합니다.
   1. FACS 수집 튜브를 분류기에 삽입하기 전에 핵 현탁액을 잠시 혼합합니다.
   2. FSC(Forward Scatter) 및 SSC(Side Scatter)를 기반으로 첫 번째 게이트 P1을 설정하여 파편과 응집체를 제외합니다(그림 4A).
   3. 비어 있거나 손상된 핵 및 멀티플렛을 제외하려면 DAPI 영역 대 DAPI 높이(DAPI-A 대 DAPI-H)를 기반으로 후속 게이트를 설정합니다(그림 4B).
   4. 3.2에서 준비된 1 U/μL RNase 억제제 용액과 함께 4% BSA/1x PBS가 들어 있는 1.5mL 수집 튜브에 단일 핵을 분류합니다.

4. 품질 관리

1. 형광 현미경 또는 자동 계수 챔버에서 최소 2개의 독립적인 계수로 최종 핵 농도를 측정하고 현탁액 품질을 평가합니다(그림 5).
   참고: 최적 농도는 700 - 1,200 nuclei/μL입니다. 700 nuclei/μL와 같은 더 낮은 세포 농도는 결과 cDNA 라이브러리가 주변 배경 RNA(개별 핵과 관련되지 않은 전사체)를 덜 포함하기 때문에 바람직할 수 있습니다.
2. 시퀀싱된 단일 핵의 원하는 회수를 위해 필요한 핵 현탁액의 부피를 계산합니다. 핵 응집 및 RNA 분해를 피하기 위해 즉시 라이브러리 준비로 진행하십시오.

결과

프로토콜의 성능을 확인하기 위해 라이브러리 준비를 위해 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Gene Expression Kit v3.1을 사용하고 Seurat 패키지^12,13으로 snRNA-seq 데이터를 분석했습니다.

그림 6은 대표적인 snRNA-seq 라이브러리의 결과를 보여줍니다. 핵의 품질을 평가하기 위해 우리는 미토콘드리아 판독의 분율로 착색된 전사체(고유 분자 식별자(UI)로 정의됨)의 수에 대해 유전자 수를 표시했습니다(그림 6A). 좋은 품질의 핵은 일반적으로 더 높은 판독 수, UMI와 유전자 수의 상관 관계, 낮은 미토콘드리아 판독 분획을 보여줍니다.

후속 분석을 위해, 500 개 미만 또는 4000 개 이상의 계수 유전자를 갖는 핵, 또는 미토콘드리아 RNA의 5 % 이상을 제외시켰다 (n = 828). 최소 3개의 핵에서 발현되는 유전자만 포함되었습니다. 우리는 나머지 6,000개의 핵에서 총 약 20,000개의 유전자를 검출했으며, 핵당 1,600개의 중앙값 유전자와 2,800개의 중앙값 UMI를 가지고 있었습니다(그림 6B).

클러스터링은 매우 가변적인 유전자를 기반으로 했습니다. 총 18개의 클러스터를 식별했습니다. 세포 동일성은 공지된 마커 유전자 (나타내지 않음)에 기초하여 주석을 달았다. 한 세포 유형의 하위 클러스터는 하나의 클러스터로 요약되어 총 11개의 별개의 세포 유형을 생성했습니다: 족세포, 근위 세뇨관(PT), 가는 사지(tL), 두꺼운 상행 사지(TAL), 원위 나선형 세뇨관(DCT), 연결 세뇨관(CNT), 수집 덕트 주 및 삽입된 세포(CD-PC, A-IC, B-IC), 골반의 심부 수질 상피(DMEP) 및 내피. 클러스터-농축 마커의 유전자 발현 패턴은 도트 플롯(도 6C)으로 시각화되었고, 세포 유형 클러스터는 t-분포 확률적 이웃 임베딩(t-SNE) 플롯(도 6D)으로 시각화되었다.

샘플의 세포 유형 분포를 평가하기 위해 각 세포 유형의 백분율을 계산하고(그림 6E) PT와 TAL의 비율을 결정하는 데 사용했습니다. PT는 주로 신장 피질에 위치하며 PT의 세포가 해리되기 쉽고 전체 신장 샘플에서 매우 풍부하기 때문에 신장 단일 세포 데이터 세트에서 자주 과대 대표됩니다. 반면에 TAL은 전체 외부 수질에 걸쳐 뻗어 있습니다¹⁴. 따라서, PT 및 TAL 분획의 비율은 신장 단일 세포 데이터 세트에서 수질 세포 유형의 농축에 대한 좋은 척도를 나타냅니다. 일반적으로 단일 세포 전체 신장 데이터 세트의 PT/TAL 비율은 8(저온 프로테아제로 처리된 전체 신장 조직의 미공개 데이터)에서 효소적으로 해리된 조직의 경우 45까지 다양했습니다^10,14,15. 여기에 제시된 snRNA-seq 데이터 세트에서 우리는 2의 PT/TAL 비율에 도달할 수 있었습니다. 이 결과는 snRNA-seq와 결합된 조직 해부 중 과도한 피질의 제거가 신장 세포 유형 표현을 현저하게 개선한다는 것을 보여줍니다.

그림 1: 워크플로의 개략도 개요. 이 프로토콜은 조직 해부, 핵 분리, 핵 분류, 최종 순도 및 농도 평가를 포함하는 4가지 주요 단계로 구성됩니다. 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 신장 해부 및 조직 준비 . (A) 해부된 전체 신장의 대표 이미지. 점선은 모든 신장 세포 유형을 나타내는 1-2mm의 중간 슬라이스를 얻는 데 필요한 절단을 나타냅니다. (B) 획득 된 중간 슬라이스의 대표 이미지. 점선은 측면에서 피질 트리밍을 위한 절단을 나타냅니다. (C) 피질이 잘린 중앙 신장 조각의 대표 이미지. 피질(C), 외부 수질(OM) 및 내부 수질(IM)이 선명하게 보입니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조직 균질화 및 핵 정제 . (A) 충분히 다진 신장 조직을 보여주는 대표 이미지. 스케일 바 = 500 μm. (B) 첫 번째 균질화 단계 후 균질화(유봉 A로 25회 스트로크, 2mL 그라인더 튜브). (C) 2차 균질화 단계 후 균질화(유봉 B, 2mL 분쇄기 튜브로 15회 스트로크). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 핵 분류를 위한 게이팅 전략. (A ) 첫 번째 게이트 P1은 파편과 골재를 배제하기 위해 FSC(Forward Scatter) 대 SSC(Side Scatter)를 기반으로 설정되었습니다. (B ) DAPI-Area(DAPI-A) 대 DAPI-Height(DAPI-H)를 기반으로 하는 후속 게이트는 비어 있거나 손상된 핵 및 다중을 제외했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 핵 분류 전후의 핵 현탁액. (ᄀ, ᄃ) DAPI로 염색 된 핵 (파란색). (비, 디) DAPI 및 명시야(BF) 채널의 오버레이입니다. 분류하기 전에 (상부 패널) 핵 현탁액에는 세포 파편과 응집체 (흰색 화살촉으로 표시됨)가 포함되어 있습니다. 분류 후 (하단 패널) 핵 현탁액이 훨씬 더 깨끗해 보입니다. DAPI로 염색된 핵의 예는 검은색 화살촉으로 표시되어 있습니다. 좋은 품질의 핵은 손상되지 않은 막으로 둥글고 매끄럽게 보이며 잘 분리되어 있는 반면, 품질이 좋지 않은 핵은 주름지고 핵막이 손실된 것처럼 보입니다. 스케일 바 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 대표적인 snRNA-seq 데이터 세트의 품질 관리 및 분석. (A) 미토콘드리아 판독 분율에 의해 착색된 고유 분자 식별자(nUMI)의 수에 대해 플롯된 유전자 수(nGene)(percent.mt). 저품질 핵은 플롯의 왼쪽 하단 사분면(n = 828)에 해당하며 후속 분석에서 제외되었습니다. (B) 6,177개의 핵(> 500개 유전자)을 나타내는 snRNA-seq 데이터 세트에서 핵당 검출된 nGene 및 nUMI의 분포 및 중앙값. 라이브러리는 핵당 ~ 8,200개의 매핑된 읽기의 중간 깊이로 시퀀싱되었습니다. (C) 개별 세포 유형(y축)에 대한 클러스터-농축 마커(x축)의 유전자 발현 패턴을 보여주는 도트 플롯. 점의 크기는 표시된 유전자를 발현하는 세포의 비율에 해당합니다. 색상은 평균 표현식에 해당합니다. (D) 확인된 세포 유형의 T-분포 확률적 이웃 임베딩(t-SNE) 플롯. (E) snRNA-seq 데이터 세트의 세포 유형 분포. PT, 근위 세뇨관; tL, 얇은 사지; TAL, 두꺼운 상행 사지, DCT, 원위 나선형 세뇨관; CNT, 연결 세뇨관; CD-PC, 덕트 주세포 수집; A-IC, A형 삽입된 세포; B-IC, B형 삽입된 세포; DMEP, 골반의 깊은 수질 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시약			최종 농도	부피 (mL)
(A) 4 % BSA / PBS
10% 소 알부민이 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)			4%	2
PBS(인산염 완충 식염수) 칼슘 또는 마그네슘이 없는 1X			-	3
(B) 0.04% BSA/PBS
4 % BSA / PBS			0.04 %	0.5
PBS(인산염 완충 식염수) 칼슘 또는 마그네슘이 없는 1X			-	49.5
(C) 핵 용해 완충액 1(NLB1)
핵 EZ 용해 버퍼			-	4
RiboLock RNase 억제제(40U/μL)			1U/μL	0.1
리보뉴클레오사이드-바나딜 복합체 (200 mM)			10 밀리엠	0.2
(D) 핵 용해 완충액 2(NLB2)
핵 EZ 용해 버퍼			-	4
RiboLock RNase 억제제(40U/μL)			1U/μL	0.1
(E) 핵 현탁액 완충액(NSB)
0.04 % BSA / PBS			-	2
RiboLock RNase 억제제(40U/μL)			1U/μL	0.05
(F) 자당 그래디언트 버퍼(10% 자당)
중량:자당 1 g
6ml의 Nuclear EZ Lysis Buffer에 녹입니다.
Nuclear EZ Lysis Buffer로 최대 10mL 채우기
0.2μm 주사기 필터를 통해 새 튜브에 여과합니다.

표 1: 용액 레시피: (A) 4% BSA/1x PBS의 준비. 0.2μm SFCA 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 여과하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. (b) 0.04% BSA/1 x PBS의 제조. 0.2μm SFCA 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 여과하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오. (c) Nuclei Lysis Buffer 1 (NLB1)의 제조. 표시된 부피는 샘플별로 제공됩니다. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. (d) Nuclei Lysis Buffer 2 (NLB2)의 제조. 표시된 부피는 샘플별로 제공됩니다. 프로토콜에 명시된 대로 사용하기 직전에 RiboLock RNase 억제제를 NLB2에 추가하십시오. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. (e) 핵 현탁 완충액(NSB)의 제조. 표시된 부피는 샘플별로 제공됩니다. 프로토콜에 명시된 대로 사용하기 직전에 RiboLock RNase 억제제를 NSB에 추가하십시오. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. (f) 자당 구배 완충액의 제조. 0.2μm SFCA 멤브레인 주사기 필터를 사용하여 여과하고 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.

토론

단일 세포 전사체학은 신장 생리학 및 질병에서 세포 유형별 유전자 발현에 대한 이해를 높입니다. 여기에서 우리는 표준화된 방식으로 snRNA-seq에 대해 냉동 마우스 신장 조직에서 고품질 단일 핵을 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법을 제공했습니다.

snRNA-seq의 경우 라이브러리 생성을 위한 입력으로 고품질 핵을 사용하고 조직 처리 중 RNA 분해를 방지하는 것이 중요합니다. 따라서 해부 직후 RNA 안정화 용액에서 조직 조각을 배양하는 것은 세포 RNA를 보호하고 안정화하는 데 필수적이며 샘플을 -80°C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 보관 자료와 같은 RNA 안정화 용액 처리 없이 냉동 조직에 이 프로토콜을 적용하는 경우 시험 실행이 필요하며 RNA 안정화 용액에서 사전 배양 없이 스냅 냉동 조직에서 RNA 무결성의 상당한 손실을 관찰했기 때문에 RNA 품질을 평가해야 합니다.

일반적으로 적절한 시료 처리는 온전한 단일 핵의 회수율을 극대화하는 데 매우 중요합니다. 모든 재현탁 단계는 전단 응력과 물리적 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 피펫팅하여 수행해야 합니다. 최종 핵 재현탁 및 핵 분류를 위한 완충액은 핵 손실 및 응집을 방지하기 위해 BSA를 포함해야 합니다.

이 프로토콜의 완충액 부피는 매우 작은 조직 샘플(~15mg)에 최적화되어 있습니다. 완전한 세포 용해와 충분한 세척을 보장하여 고품질 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. 더 큰 조직 블록 또는 전체 신장 샘플은 과도한 핵 농도를 초래하여 응집 및 응집, 주변 RNA의 높은 풍부함 및 전반적인 현탁액 품질 저하를 초래합니다. 더 큰 샘플 또는 기타 조직을 처리하는 경우 최소 주변 RNA 수준에 대한 최적의 완충액 부피를 결정하기 위해 시험 실행을 수행하는 것이 좋습니다. 핵과 RNA의 품질과 농도는 과부하로 인해 전반적인 성능이 저하되므로 주의 깊게 검사해야 합니다.

또한, 단일 핵과 관련되지 않은 높은 수준의 주변 RNA를 유발하는 다량의 세포 파편은 시퀀싱 결과에 부정적인 영향을 미칩니다. 수크로오스 쿠션을 통한 원심분리에 의한 핵 현탁액의 정화는 이러한 문제를 어느 정도 완화시키지만, 예를 들어 면역 세포에 존재하는 조밀하고 작은 핵에 대한 반대 선택에 의해 세포 유형 표현의 편향을 초래할 수도 있다¹⁶. 이것이 우려되는 경우 자당 구배를 생략해야 합니다. 대조적으로, 우리는 DAPI 염색을 기반으로 한 유세포 분석이 고품질의 단일 핵 현탁액을 생성하기 위해 세포 파편의 양을 줄이는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.

단일핵의 분리는 단일세포접근법(single-cell approach)⁸과 비교했을 때 상당한 이점을 갖는다. 적절하게 냉동 된 조직과 호환되어 조직 수집을보다 유연하게 만들고 효소 기반 조직 해리의 필요성을 우회하여 전사 스트레스 반응을 유발할 수 있습니다 ^6,17. 또한, 신장 피질의 쉽게 해리 가능한 세포 유형의 선택을 선호하는 해리 편향을 극복하여 일부 효소 기반 접근법 ^5,6,10에서 수질 세포 유형의 과소 대표로 이어질 수 있습니다.

전체 신장 조직 대신 중앙 신장 조각을 사용하면 자원을 더욱 절약하고 앞서 설명한 바와 같이 풍부한 세포 유형의 과대 표현을 교정합니다¹⁰. 그러나 조사된 마우스 모델이나 표현형에 따라 단일 중간 조각 대신 전체 신장 샘플을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 전체 신장 샘플은 실제 세포 비율 또는 전체 신장에서 발생하는 변화를 더 잘 나타낼 수 있는 반면, 트리밍된 중간 슬라이스는 수질 표현형 또는 샘플 재료가 제한적인 경우에 유리한 것으로 입증되었습니다. 따라서 이 결정은 매우 사용자별로 다르므로 신중하게 고려해야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell sorter	-	-	For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter.
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	5811000015
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10228
Countess II FL Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF1000	Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope.
4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI)	Biotrend	40043/b	Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM.
D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free	VWR	0335-500G
DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	22431021
Ethanol, 70 %	-	-
FACS tubes	pluriSelect	43-10100-46
KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma-Aldrich	D8938-1SET
Minisart Syringe Filters 0.2 µm	Sartorius	16534-GUK
Nuclease-free Water	Invitrogen	AM9937
Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit	Sigma-Aldrich	NUC-101	Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation.
PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium	Corning	21-040-CV
Petri dishes, polystyrene 60 mm	Sigma-Aldrich	P5481
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	SRE0036
pluriStrainer Mini 100 µm	pluriSelect	43-10100-46
pluriStrainer Mini 20 µm	pluriSelect	43-10020-40
pluriStrainer Mini 40 µm	pluriSelect	43-10040-40
Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL)	Falcon	352099
Razor blades	-	-
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)	Thermo Fisher	EO0384
Ribonucleoside-vanadyl complex	New England Biolabs	S1402S	Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C.
RNAlater Stabilization Solution	Invitrogen	AM7020
RNase AWAY	Fisher Scientific	11952385