파라핀 조직 샘플의 단일 세포 분석에서 면역 프로파일링 및 공간 매핑 특성 분석을 위한 멀티플렉스 바코드 이미지 분석

요약

다중화 바코드 이미지 분석은 최근 종양 미세 환경의 특성을 개선하여 세포 구성, 기능 상태 및 세포-세포 상호 작용에 대한 포괄적인 연구를 가능하게 했습니다. 본 명세서에서는 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 바코딩을 사용하는 염색 및 이미징 프로토콜과 고차원 이미지 분석 기술을 사용할 수 있는 사이클 이미징을 설명합니다.

초록

동일한 조직 절편에서 여러 에피토프를 순차적으로 검출하는 올리고뉴클레오티드와 함께 항체 바코드를 사용하는 멀티플렉스 이미징 기술은 종양 미세환경에 대한 이해를 높이는 효과적인 종양 평가 방법론입니다. 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직에서 단백질 발현의 시각화는 특정 형광단이 상보적인 올리고뉴클레오티드를 통해 항체 결합 바코드에 어닐링된 다음 샘플 이미징을 수행할 때 달성됩니다. 실제로, 이 방법은 단일 조직 염색 반응에서 40개 이상의 항체로 구성된 맞춤형 패널을 사용할 수 있습니다. 이 방법은 신선 냉동 조직, 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직, 배양 세포 및 말초 혈액 단핵 세포와 호환되므로 연구자들은 이 기술을 사용하여 단일 세포 분해능으로 다양한 샘플 유형을 볼 수 있습니다. 이 방법은 수동 염색 및 고정 프로토콜로 시작하며 모든 항체 바코드는 항체 칵테일을 사용하여 적용됩니다. 염색 유체 기기는 완전히 자동화되어 있으며 표준 형광 현미경을 사용하여 모든 바이오마커를 이미지화할 때까지 스펙트럼적으로 구별되는 형광단을 라벨링, 이미징 및 제거하는 반복적인 주기를 수행합니다. 그런 다음 모든 이미징 주기에 걸쳐 이미지를 수집하고 컴파일하여 모든 마커에 대한 단일 셀 해상도를 달성합니다. 단일 단계 염색 및 부드러운 형광단 제거를 통해 고도로 다중화된 바이오마커 분석이 가능할 뿐만 아니라 원하는 경우 추가 다운스트림 분석(예: 헤마톡실린 및 에오신 염색)을 위해 샘플을 보존할 수 있습니다. 또한 이미지 분석 소프트웨어는 이미지 처리(드리프트 보상, 배경 빼기, 세포 분할 및 클러스터링)뿐만 아니라 공간 네트워크 맵 생성을 위한 이미지 및 세포 표현형의 시각화 및 분석을 가능하게 합니다. 요약하면, 이 기술은 전산화된 미세유체 시스템과 형광 현미경을 사용하여 조직 결합, 올리고뉴클레오티드 접합 항체에 상보적인 형광 표지 DNA 프로브를 반복적으로 혼성화, 이미징 및 스트립합니다.

서문

종양 미세환경(TME)은 종양 세포, 종양 기질 세포, 면역 세포, 세포외 기질의 비세포 구성 요소 및 종양, 기질 및 면역 세포에 의해 생성 및 방출되는 수많은 풍부한 분자로 구성된 매우 이질적입니다 ^1,2. 축적된 증거는 TME가 종양 분화, 성장, 침윤, 전이 및 치료법에 대한 반응을 재프로그래밍하는 데 중추적인 역할을 한다는 것을 입증한다³.

TME의 다양한 세포 유형이 신호 네트워크를 통해 상호 작용하고 서로 통신하는 방법을 이해하는 것은 암 진단을 개선하고 면역 요법을 최적화하며 새로운 치료법을 개발하는 데 필수적입니다⁴. 면역조직화학(IHC) 및 면역형광법(IF)을 포함한 전통적인 조직 현미경 기술은 종양 샘플의 세포 유형, 풍부도 및 통신을 연구하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 불행하게도, 이러한 기술은 전형적으로 조직 절편에서 하나 또는 두 개의 단백질 마커만을 평가할 수 있으며, 이들 세포^사이의 복잡한 공간적 및 구조적 관계를 밝힐 수 없다 ^5,8,7.

지난 20 년 동안 여러 다중화 이미징 기술이 확립되었습니다⁸. 이러한 기술은 TME 내 면역 세포의 구성, 기능 및 위치에 대한 훨씬 향상된 관점을 제공하여 단일 세포 수준에서 복잡한 TME를 식별하고 공간적으로 프로파일링하는 능력의 급속한 발전으로 이어진다 ^9,10. TME에서 다양한 종양 및 면역 세포의 공간적 및 구조적 관계는 이제 이러한 다중화 이미징 기술을 사용하는 생물학적 및 임상 연구의 최전선에 있습니다^11,12.

올리고뉴클레오티드-접합 항체 바코딩을 사용하여 최근에 개발된 다중화 이미징 기술은 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 샘플^13,14에서 올리고뉴클레오티드 접합 항체의 검출을 기반으로 하는 영향력 있는 단일 세포 생물학적 연구 플랫폼입니다. 현재, 이러한 다중화 이미징 기술은 단일 조직 섹션⁽¹⁵)에서 100개 이상의 마커의 동시 이미징을 가능하게 하며, 이는 현장에서 구별할 수 있는 세포 유형의 수를 증가시켰다. 이를 통해 종양 및 면역 세포에 대한 공간 분석이 가능해졌는데, 이는 전통적인 면역표현형 접근법으로는 불가능한 수준이다¹⁶.

여기에서 우리는 정제된 항체를 올리고뉴클레오티드에 접합하고 다중화 이미징 플랫폼과 FFPE 조직을 사용한 다중 사이클 이미징 절차를 사용하여 이 접합을 검증하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 또한 이 기술과 함께 사용되는 기본 이미지 처리 및 데이터 분석 절차에 대해 설명합니다.

프로토콜

이 후향적 연구는 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. FFPE 조직 샘플은 일상적인 표준 치료의 일환으로 MD Anderson의 환자로부터 수집되었습니다. 진단적 또는 치료적 개입은 수행되지 않았다. 연구 및 출판을 위해 수집된 샘플을 사용하는 것에 대해 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 항체 패널 설계에 사용되는 항체 공급원

1. 관심 있는 조직과 단백질의 품질을 신중하게 고려한 후 다중화 이미징을 위한 항체 패널을 만듭니다. 항체 패널 설계를 위해 1) 완전히 상업적으로 검증된 항체, 2) 다중화 이미징 기술 스크리닝 항체 및 3) 최종 사용자 공유 항체의 세 가지 항체 공급원이 고려됩니다.
   참고: 멀티플렉스 이미징 기술 스크리닝 항체는 효과가 있는 것으로 나타났으며 공급업체에서 구입할 수 있습니다. 이러한 스크리닝된 항체는 사용자에 의한 올리고뉴클레오티드 접합 후 다중화 이미지 염색에 적용할 수 있습니다.
2. 관심있는 단백질이 상기 언급된 공급원에서 발견될 수 없는 경우, IHC와 함께 작용하는 것으로 알려진 항체 클론을 이용한다. 또한 IgG 클론보다 IgM의 실패율이 높기 때문에 이 다중화 이미징 기술에는 IgM 클론이 아닌 IgG 이소타입이 권장됩니다.

2. 항체 접합 전

1. 다중화 이미징 바코드를 사용하여 접합을 위한 항체 클론을 식별할 때 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 유사한 완충액에서 캐리어가 없는 항체를 구입하는 것이 좋습니다. BSA, 글루텐, 글리세롤 및 기타 단백질 첨가제를 포함한 운반체 단백질은 접합 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있습니다.
2. 가장 적합한 항체 클론을 선택하고 접합 전에 항상 염색 조건(즉, 항원 검색 및 적정)을 최적화하십시오. 표준 IF 또는 IHC를 사용하여 이 항체에 대해 양성 및 음성 조직에 비접합 항체 클론을 적용하여 이를 수행합니다.
   참고: 정제된 항체가 상업적으로 이용 가능하지 않은 경우, 접합 전에 항체 정제 공정을 수행해야 합니다. 항체 정제 키트와 함께 사용되는 정제 절차는 본원에서 논의되지 않는다.

3. 항체 접합

1. 항체 접합 시약을 얻습니다. 시판되는 접합 키트는 필터-차단 용액, 환원 용액 2, 접합 용액, 정제 용액, 항체 저장 용액 (모두 4°C에서 저장) 및 환원 용액 1 (-20°C에서 저장)을 함유한다.
2. 활용
   참고: 정제된 항체를 환원제로 처리하여 항체의 환원된 부분이 이 기술과 함께 사용되는 다중화 이미징 바코드와 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있도록 합니다. 이 과정은 약 4.5시간이 걸리며 약 120μL의 접합 항체가 생성되며 이는 1년 동안 생존할 수 있습니다. 모든 스핀-다운은 실온(RT)에서 수행되고, 유동-스루는 수집 튜브가 접합된 항체를 함유하는 매우 마지막 단계(3.2.9)를 제외하고 폐기된다.
   1. 50 kDa 분자량 컷오프 필터 컬럼에 피펫을 사용하여 500 μL의 필터 블로킹 용액을 여과하고 여과하고, 12,000 x g 에서 2분 동안 스핀다운하여 비특이적 항체 결합을 차단한다.
      알림: 컬럼 상단의 잔류 용액이 눈에 띄면 수집 튜브의 필터를 뒤집고 3,000 x g 에서 2분 동안 회전합니다.
   2. 100 μL 부피의 용액 중 50 μg의 항체를 필터 컬럼에 피펫팅하고, 12,000 x g 에서 8분 동안 스핀다운시킨다.
      참고: 분광 광도계를 사용하여 정제된 항체의 농도를 측정하고 항체 50μg에 해당하는 용액의 부피를 계산합니다. 항체 용액의 부피가 100μL 미만인 경우 1x PBS를 추가하여 부피를 100μL로 조정합니다. 접합 확인을 위해 1μg의 비접합 항체를 보유합니다(단계 4.4).
   3. 260 μL의 환원 마스터 믹스(20 μL의 환원 용액 1과 825 μL의 환원 용액 2를 혼합하여 3개의 항체 접합 반응에 충분함)를 각 필터 컬럼에 피펫팅합니다. 마스터 믹스를 2-3초 동안 부드럽게 소용돌이치거나 위아래로 피펫하여 용액을 항체와 혼합합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
   4. 배양 후 필터 컬럼을 12,000 x g 에서 8분 동안 회전시킵니다. 450μL의 접합 용액을 필터 컬럼에 추가하고 12,000 x g 에서 8분 동안 스핀다운합니다.
   5. 10 μL의 뉴클레아제가 없는 물과 210 μL의 접합 용액에 원하는 바코드를 재현탁합니다.
      참고: 염색을 위해 사용하기 직전에 항체 태그를 준비하십시오. 항체 바코드 분취액을 재사용하지 마십시오.
   6. 단계 3.2.4에서 스핀다운이 완료된 후, 재현탁된 항체 태그(약 220 μL)를 각각의 상응하는 필터 컬럼에 첨가한다. 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 시약을 혼합합니다. 필터 컬럼 뚜껑을 닫고, 2시간 동안 RT에서 접합 반응을 배양한다. 2시간 후 필터 컬럼을 12,000 x g 에서 8분 동안 회전시킵니다.
      참고: 중합효소 연쇄 반응 튜브에 공액 5μL를 따로 보관하고 4°C에서 보관하는 것이 확인 프로토콜에 권장됩니다(아래 참조).
   7. 정제 용액 450 μL를 각 필터 컬럼에 피펫팅하고, 12,000 x g 에서 8분 동안 스핀다운시킨다. 세 번 반복하십시오.
   8. 100 μL의 저장 용액을 필터 컬럼에 피펫팅합니다. 혼합물을 위아래로 10회 이상 부드럽게 피펫팅하고 컬럼의 필터 측면을 조심스럽게 세척합니다.
      참고: 50μg의 항체를 100μL의 저장 용액에 녹입니다. 접합 반응이 50 μg 이상의 항체로 시작되면 이 비율로 더 많은 저장 용액을 추가합니다.
   9. 새 수집 튜브에서 필터 컬럼을 뒤집습니다. RT에서 3,000 x g 에서 2분 동안 회전합니다. 수집된 용액을 보관하십시오. 접합된 항체 용액을 멸균 스크류 탑 튜브에 피펫팅하고 4°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
      참고: 접합 항체는 2일 후에 다중 이미징 기술로 테스트해야 합니다. 이에 앞서 실험하면 높은 배경 핵 염색이 발생할 수 있습니다.

4. 접합 확인

참고: 다중화 이미징 기술을 사용하여 사용자 접합 항체로 염색 실험을 수행하기 전에 접합 항체 5μL(단계 3.2.6 참조)와 비접합 항체 1μg(일반적으로 혼합물 2μL)을 대조군으로 사용하여 접합을 확인해야 합니다. 성공적인 항체 접합은 항체의 분자량 증가로 입증됩니다. 그러나 이 확인 프로토콜은 접합을 위한 화학 반응의 성공 여부만 평가하고 다중 이미징에 사용되는 항체 검증은 다루지 않습니다.

1. 8 μL 및 11 μL의 뉴클레아제가 없는 물을 각각 예비 접합 항체 및 대조군 비접합 항체에 넣고, 최종 부피 13 μL를 얻었다.
2. 5 μL의 LDS (또는 다른 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 시스템) 샘플 완충액 및 2 μL의 샘플-환원제를 각각의 샘플에 넣고, 샘플을 95°C 건조 욕에서 10분 동안 변성시킨다.
3. 샘플이 변성되는 동안 40mL의 MOPS SDS 실행 버퍼를 760mL의 초순수에 희석하고 전기 영동 시스템의 탱크에 겔을 넣고 희석된 실행 버퍼를 겔 위에 붓습니다.
4. 10분의 변성 기간이 완료되면 겔의 한 웰에 사전 염색된 단백질 표준물을, 다른 웰에는 비접합 항체(단계 3.2.2)를, 나머지 웰에는 접합된 항체 샘플을 로드합니다. 다음으로, 젤의 끝에 단백질 표준이 나타날 때까지 150V에서 젤을 실행합니다.
   알림: 젤은 전자레인지용 용기에 쉽게 달라붙어 찢어질 수 있으므로 다음 단계에서 젤을 주의해서 다루어야 합니다.
5. 실행이 완료되면 초순수로 미리 채워진 전자레인지용 용기에 젤을 옮기고 물의 첫 번째 거품이 시각화될 때까지 전자레인지에서 가열합니다.
   알림: 기포가 형성되는 시간은 사용하는 전자레인지에 따라 크게 다릅니다.
6. 용기에서 물을 빼고 젤 위에 약 250mL의 Coomassie G-250 얼룩을 붓고 첫 번째 거품이 시각화될 때까지 전자레인지에서 젤을 가열합니다. 그런 다음 전자레인지에서 젤과 Coomassie G-250 얼룩이 있는 용기를 꺼내 셰이커에 10분 동안 올려 놓습니다.
7. 흔들어 준 후 얼룩을 조심스럽게 배출하고 약 200mL의 초순수로 교체한 후 용기를 셰이커에 올려 겔을 세척합니다.
8. 초순수를 배출하고 새 초순수로 5회 교체하거나 수조에 얼룩의 잔여물이 보이지 않을 때까지 교체합니다. 젤을 촬영하기 전에 필요한 경우 밴드가 보일 때까지 셰이커에서 밤새 젤을 세척합니다(그림 1).
   참고: 다중화 이미징에 사용되는 항체는 염료 결합 항체와 유사한 염색 패턴을 가져야 합니다. 접합 항체에 대해 양성인 것으로 알려진 항원이 있는 조직 절편은 올리고뉴클레오티드 접합 및 염료 접합 항체로 염색할 수 있습니다. 이 연구에서, 각각의 경우, 두 항체 유형에 대한 조직 형태는 서로 동등하고 조화를 이루었을 뿐만 아니라 관심 있는 단백질과 테스트 조직 샘플의 생물학을 기반으로 예상되는 세포 분포를 기반으로 했습니다. 이 결과는 FFPE 조직을 사용하는 조직 염색 기반 접근법에 올리고뉴클레오티드 접합 항체 모이어티를 사용하는 효과를 입증합니다.

5. 올리고뉴클레오티드 접합 항체 염색

1. 조직 배치를 위한 커버슬립을 준비합니다.
   1. 조직 부착도를 향상시키기 위해 실온에서 24시간 동안 0.1% 폴리-L-라이신 용액에 커버슬립을 담그십시오.
   2. 담근 후 폴리-L-라이신 용액을 배출하고 커버슬립을 초순수로 30초 동안 세척합니다. 세척을 4-6 번 반복하십시오. 세탁에 사용되는 초순수에서 커버슬립을 제거하고 보푸라기가 없는 수건에 올려 밤새 건조시킵니다.
      참고: 조직학자는 선택한 조직을 5μm 두께의 섹션으로 절단하고 폴리-L-라이신으로 충전된 커버슬립의 중앙에 놓고 밤새 건조시켜야 합니다. 건조 후 조직 절편이 있는 커버슬립은 4°C에서 6개월 이상 보관하지 않아야 합니다. 이 프로토콜의 염색 패널에는 26개의 마커가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 조직은 정상 인간 편도선 조직이었습니다. 커버슬립 담금 시간은 1주일을 초과해서는 안 됩니다. 폴리-L-라이신 코팅 커버슬립은 RT에 보관할 수 있으며 준비 후 2개월 이내에 사용해야 합니다.
2. 염색 전날 커버슬립 홀더를 60°C 오븐에 하룻밤 동안 넣습니다.
3. 다음 날, 커버슬립 샘플을 60°C 오븐에서 예열된 커버슬립 홀더에 넣습니다. 30분 동안 구운 후 파라핀이 조직에서 녹았는지 확인합니다.
4. 커버슬립 홀더/s를 다음 용액 시리즈에 빠르게 배치합니다: 각각 6분 동안 두 차례의 탈왁스제; 각각 5 분 동안 100 % 에탄올 2 회; 5 분 동안 90 % 에탄올 1 라운드; 5 분 동안 70 % 에탄올 1 라운드; 5 분 동안 50 % 에탄올 1 라운드; 5 분 동안 30 % 에탄올 1 라운드; 그리고 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 처리된 초순수 2회를 각각 5분 동안 담급니다.
   참고: 에탄올의 모든 희석액은 DEPC 처리된 초순수로 준비됩니다. 자일렌을 탈랍에 사용하는 경우 후드에 사용해야 합니다.
5. 커버슬립 홀더/샘플을 용액 시리즈에 적용하는 동안 다음을 수행하십시오.
   1. 바닥에 물에 적신 종이 타월이 있는 빈 피펫 팁 상자를 놓아 습도 챔버를 준비합니다.
   2. 압력솥에 50mL 비커를 반쯤 덮을 만큼 충분한 물을 채웁니다.
   3. 4°C에서 시료당 메탄올 5mL를 비이커에 넣습니다.
   4. AR9 완충액을 DEPC 처리된 초순수로 1x로 희석합니다. 커버슬립 홀더당 약 50mL의 희석된 완충액이 필요합니다.
6. 용액 시리즈가 완료되면 50mL 유리 비커에 약 40mL의 1x AR9 버퍼를 채우고 커버슬립 홀더/샘플을 비커에 담그고 비커/커버슬립 홀더를 알루미늄 호일로 완전히 덮습니다.
   1. 알루미늄 호일로 덮인 비커/커버슬립 홀더를 물이 채워진 압력솥에 넣고 고압(약 15psi)에서 20분 동안 요리합니다.
   2. 조리 후 비커/커버슬립 홀더를 제거하고 알루미늄 호일의 포장을 조심스럽게 풀고 비커/커버슬립 홀더를 실온에서 약 10분 동안 식힙니다.
   3. 커버슬립 홀더/s를 제거합니다.amp1x AR9 버퍼에서 9 버퍼를 제거하고 DEPC 처리된 초순수 2회에 담그고 s를 수행합니다.amp두 라운드에서 각각 2분 동안 les.
   4. 배양 중에 다중화 이미징 염색 키트에서 수화 완충액, 차단 N, 차단 G, 차단 J 및 차단 S 용액과 항체 희석제/차단을 검색합니다. 두 개의 커버슬립 샘플의 경우 그림 2에 표시된 구성을 사용하여 용액에 대해 6웰 플레이트에 레이블을 지정합니다.
   5. 커버슬립 샘플을 각각 2분 동안 5mL의 수화 버퍼에 두 번 넣습니다.
   6. 수화 완충액에 두 차례 배치한 후 커버슬립 샘플을 5mL의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제/블록에 넣고 RT에서 20-30분 동안 배양합니다(30분을 초과하지 않음).
   7. 배양하는 동안 다중 이미징 항체 희석제/차단제, N 차단제, G 차단제, J 차단제 및 S 차단제 용액의 마스터 믹스 200μL를 만들어 항체 칵테일을 준비합니다.
      참고: 마커 수와 각 마커의 검증된 적정을 기반으로 총 항체 양을 계산하고 마스터 믹스에서 총 항체 양을 뺍니다. 예를 들어, 각각 1:200 적정을 가진 6개의 마커의 경우 방정식은 마스터 믹스 200μL - 항체 칵테일 6μL = 마스터 믹스 194μL입니다.
7. 다중 이미징 항체 희석액/블록에서 배양한 후 커버슬립 샘플을 5.5.1단계에서 제조한 습도 챔버에 넣고 항체 칵테일 190μL를 커버슬립 샘플에 피펫팅하고 커버슬립 샘플을 RT에서 3시간 동안 배양합니다.
   1. 배양 후, 커버슬립 샘플을 5mL의 멀티플렉스 이미징 항체 희석제/블록으로 각각 2분 동안 두 라운드로 세척합니다.
   2. 결합된 항체를 커버슬립의 조직에 고정하려면 습도 챔버에서 5.7.3-5.7.5단계를 수행하십시오.
   3. 저장 용액으로 16% 포름알데히드를 1.6%로 희석하여 커버슬립을 10분 동안 배양한 다음 1x PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
   4. 커버슬립을 4°C 메탄올로 5분 동안 인큐베이션한 다음 1x PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
   5. 1x PBS로 희석한 5mL의 고정제 시약으로 커버슬립을 20분 동안 배양한 다음 1x PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.
   6. 염색된 커버슬립 샘플을 4°C의 보관 완충액에 최대 2주 동안 보관합니다

6. 다중화 이미징 리포터 플레이트

참고: 개별 웰에 바코드화된 형광단을 포함하는 리포터 플레이트라고 하는 96웰 플레이트는 맞춤형으로 설계된 다중 이미징 실험에 따라 준비되며 각 염색된 커버슬립과 상관 관계가 있습니다.amp르. 다음 단계는 리포터 플레이트를 준비하기 위한 것입니다.

1. 뉴클레아제가 없는 물 4,880μL, 10x 멀티플렉스 이미징 버퍼 600μL, 분석 시약 500μL, 핵 염색 용액 20μL를 결합하여 리포터 마스터 믹스를 준비합니다. 이것은 모든 우물의 20주기에 충분할 것입니다.
2. 맞춤형으로 설계된 멀티플렉스 이미징 실험의 모든 주기에서 리포터 마스터 믹스와 해당 주기에 대한 특정 바코드 형광단이 포함된 용액 245μL로 웰을 채웁니다.
   참고: 암종 패널에 대해 이 프로토콜에 사용된 리포터 플레이트 구성은 그림 3 을 참조하십시오.
3. 바코드가 부착된 형광단을 보호하려면 리포터 플레이트 위에 호일 플레이트 덮개를 부착하고 플레이트를 다중화 이미징 기기 내에 놓습니다.
4. 리포터 플레이트를 4°C의 어두운 상자에 최대 2주 동안 보관하십시오.

7. 다중화 이미징 기계 교정 및 실행

참고: 고해상도 이미징 형광 현미경은 20x, 100% 여기광, 낮은 광표백으로 각 다중화 이미징 주기에서 4개의 서로 다른 형광 채널을 캡처합니다.

1. 현미경 스테이지에 샘플 커버슬립을 놓고 1:1,500 적정 핵 염색 용액 700μL를 조직에 수동으로 피펫팅하여 DAPI 채널을 사용하여 이미징의 초점을 보정합니다.
   참고: 커버슬립은 현미경 단계에 유지됩니다.tage 동안 샘플 세척 및 이미징.
2. 다중화 이미징 기기를 준비하기 위해 DEPC 처리 초순수를 사용하여 10x 다중화 이미징 버퍼를 1x로 희석하고 희석된 1x 다중화 이미징 버퍼, DEPC 처리 초순수 및 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 포함한 적절한 용액/용매로 시약 병을 채웁니다.
3. 시약 병이 적절하게 채워지면 다중화 이미징 기기 관리자 소프트웨어에 실험 설계를 입력합니다. 각 주기에 대한 올바른 주기, 웰 번호, z-스택 위치, 마커 이름, 클래스 및 노출 시간을 지정합니다(그림 4). 모든 현미경 매개 변수를 설정하십시오. 을 클릭하고 이미지화할 샘플 커버슬립에서 관심 영역을 선택합니다.
   1. 제어 소프트웨어에서 실험 버튼을 클릭합니다(그림 4A). 실험 설정 및 관리 창에서 새 템플릿 단추를 클릭합니다(그림 4B).
   2. 프로젝트 단추 옆의 공간에 프로젝트 이름을 입력합니다(그림 4C). 총 사이클 수를 입력하거나 선택합니다(그림 4D).
   3. Channel Assignment 버튼을 클릭하고, 각 사이클에 대한 정보를 열에 입력하고(그림 4E), Save Template 버튼을 클릭합니다. 실험 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다.
      참고: 멀티플렉스 이미징 실험 중에 기기는 리포터 플레이트의 한 웰에서 바코드화된 형광단(DAPI를 포함하여 웰당 최대 4개의 형광단)을 검색하여 샘플 커버슬립에 직접 분배하고 각 형광 채널의 관심 영역을 이미지화합니다. 해당 주기에 대한 모든 이미징 후, 기기는 바코드가 부착된 형광단을 씻어내고 다음 주기의 리포터(리포터 플레이트의 다음 웰에서)를 분배합니다. 이미징은 26개의 마커를 사용하는 모든 주기가 완료될 때까지 계속됩니다.

8. 이미지 수집

참고: 4개의 형광 채널(DAPI, Cy3, Cy5 및 Cy7)로 구성되고 Plan Fluor 20x 렌즈가 장착된 적응형 도립 형광 현미경을 사용하여 멀티플렉스 이미지를 수집할 수 있습니다. 커버슬립 샘플의 이미징 및 세척은 특별히 개발된 유체 공학 설정을 사용하여 자동으로 반복적으로 수행됩니다. 이미지는 QPTIFF 형식의 프로세서 소프트웨어(v1.8.0.7)를 사용하여 획득됩니다.

1. 프로세서 창에서 입력 단추를 클릭하고 실험 이름을 선택합니다.
2. Processing Options(처리 옵션) 섹션에서 Background Subtraction(배경 빼기), Deconvolution(디콘볼루션), Extended Depth of Field(확장된 피사계 심도) 및 Shading Correction(음영 보정)을 선택하고 선택합니다. 시작 버튼을 클릭합니다.

9. 이미지 분석

참고: 획득한 이미지는 다운스트림 분석을 위해 특허받은 자동 이미지 분석 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램(그림 5)에 업로드할 수 있습니다.

1. 컴퓨터에서 QuPath 아이콘을 클릭하고 소프트웨어를 엽니다. QPTIFF 파일을 뷰어 창으로 끕니다.
2. Brightness & Contrast 버튼을 클릭하면 Brightness & Contrast 창이 열립니다. 선택됨 열에서 마커를 선택하거나 선택 취소하여 마커 신호를 표시하거나 닫습니다.
3. Zoom to fit 버튼을 클릭하여 관심 영역을 확대 또는 축소합니다.
   참고: 멀티플렉스 이미지 데이터 시각화는 사용자에게 조직 미세 환경에 대한 심층 분석을 제공합니다. FFPE 샘플의 개별 마커는 형광 형식(그림 6 및 그림 7) 또는 병리학 보기로 시각화할 수 있습니다. 여러 계산 플랫폼을 사용하여 복합 이미지를 처리하고 다중화된 조직 이미지 데이터를 분석할 수 있습니다. 이 소프트웨어를 사용하면 다중화 이미징 기술을 통해 생성된 초고도 다중화 조직의 전체 슬라이드 이미지로 공간 표현형과 희귀 세포 발견 및 세포 이웃 계산을 수행할 수 있습니다. 암종 패널 및 편도선 샘플의 26개 항체에 대해서는 그림 6 을 참조하십시오(보충 그림 1).

결과

우리는 바코드 이미지 분석 시스템을 사용하여 FFPE 조직의 면역 상태를 설명하기 위해 FFPE 편도선 샘플을 사용하여 26개의 마커 면역 종양학 패널을 개발했습니다. 전반적으로, 19 항체는 현재 우리 실험실의 다른 다중 이미징 연구에 사용됩니다. 모든 마커는 발색 IHC가 있는 FFPE 조직을 사용하여 테스트되었습니다. 모든 항체는 독특한 DNA 올리고뉴클레오티드에 접합되었다. 이 바코드 이미지 분석 기술을 위해 웹 기반 기기 관리자(그림 4)를 사용하여 커버슬립을 설정할 때 첫 번째 주기와 마지막 주기는 항상 "비어 있음"(그림 2 및 그림 4)으로 항체의 특정 신호에서 배경 형광 신호를 뺄 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 형광 현미경으로 QPTIFF 형식의 이미지를 수집한 후 특허받은 여러 자동 이미지 분석 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어 프로그램을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 합성 이미지는 신호를 더 잘 볼 수 있도록 모든 마커 또는 선택한 마커를 표시할 수 있습니다(그림 5). 또한, 각각의 항체는 핵, 세포질, 또는 막 국소화에 대해 육안으로 평가될 수 있다. 면역, 종양 및 기질 세포를 쉽게 식별할 수 있습니다. 그 후, 이미지 분석을 통해 모든 마커의 신호 강도, 동적 범위 및 공간 분포에 대한 정보를 제공할 수 있습니다(그림 6). 이 기술을 통해 단일 조직 섹션의 세포 내 수준에서 26개의 마커를 모두 분석할 수 있었습니다(그림 7). 마커의 공동 국소화를 분석하여 세포 표현형을 식별하고, 공간 세포 위치를 파악하고, 세포 사이의 거리를 계산하고, 세포 분포를 찾을 수 있습니다. 이 기술의 결정적인 영향은 조직 미세 환경의 면역 상태에 초점을 맞춘 강력한 26 마커 패널의 제시입니다.

그림 1: Bis-Tris 단백질 젤을 사용한 맞춤형 접합 항체 검증 이미지. 겔의 레인 1은 단백질 표준을 나타낸다. 레인 2 및 레인 4는 바코드-접합 항체(화살표)를 나타낸다. 레인 3 및 레인 5는 비접합 항체(화살촉)로부터의 중쇄 및 경쇄 밴드를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 두 개의 커버슬립 샘플에 대한 염색 플레이트 구성 맵. 약어: HB = 수화 완충액; B = 항체 희석제/블록; PSFS = 염색 후 정착액; PBS = 인산염 완충 식염수; MeOH = 메탄올; S = 스토리지 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 리포터 플레이트 구성. 각 접합 항체에는 특정 리포터를 보완하는 바코드가 있습니다. 리포터 플레이트를 설정하려면 모든 접합 항체와 해당 리포터를 나열해야 합니다. 다음으로, 각 항체에는 사이클 번호가 할당됩니다. 2개의 블랭크 사이클(C1 및 C18)의 성능은 3개의 형광 채널에서 자가형광 수준을 평가하고 이미지 획득 제어 소프트웨어를 사용하여 이미징 후 배경 감산에 사용됩니다. 소프트웨어 마법사는 이 단계에서 계측기를 점검하여 모든 설정이 올바른지 확인합니다(그림 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 실험 설정을 위한 제어 소프트웨어를 사용한 이미지 획득. (A) 제어 소프트웨어의 왼쪽 하단 모서리에 있는 실험 탭을 선택하여 설정을 준비하고 시작합니다. (나,씨) 새 템플릿을 선택하여 새 프로젝트 및 실험 이름으로 실험 설정을 입력합니다. (D) 96-웰 리포터 플레이트에서 리포터 위치를 반영하기 위해 시작 사이클 웰 및 사이클 수를 변경한다. (E) 실험 실행을 위해 지정된 4개의 채널에 적절한 형광 채널을 할당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 웹 기반 소프트웨어(QuPath)를 사용한 이미지 시각화. 뷰어 창에는 염색된 편도선 조직 FFPE 섹션에 26개의 마커가 표시됩니다. Brightness & Contrast(밝기 및 대비 ) 창에는 확인 표시가 있는 마커가 표시됩니다. 마지막으로 뷰어 창에는 선택한 마커가 있는 FFPE 샘플이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 웹 기반 소프트웨어를 사용한 이미지 시각화. (A) 26개의 마커에 대해 편도선 조직 절편을 염색하고 주석 및 검토를 위해 상용 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어 또는 오픈 소스 소프트웨어(QuPath)를 사용하여 QPTIFF 형식의 절편 이미지를 시각화했습니다. (BF) 신호를 더 잘 볼 수 있도록 동일한 주석에 6개의 마커가 표시되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: 웹 기반 소프트웨어에 사용되는 26개의 개별 마커 보기. 편도선 조직에서의 마커 발현은 면역 종양학 패널(왼쪽 상단)을 사용한 면역형광 염색을 통해 표시됩니다. 두 개의 작은 영역(빨간색 직사각형)에 개별 마커가 표시됩니다. 확대된 삽입물은 이러한 마커에 대해 양성인 셀을 표시합니다(흰색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8: 다중화된 이미지 획득 워크플로 요약. FFPE 조직 절편은 26개의 항체 패널을 사용하여 염색한 후 다주기 반응을 일으켰습니다. 염색된 절편의 Raw 이미지를 전산적으로 처리하고, 합성 이미지를 이용하여 세포 밀도 및 공간 분석을 수행하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 편도선 조직에서의 IHC 검증. FFPE 조직 절편은 개별 항체를 사용하여 염색하였다. 편도선 조직의 마커 발현은 낮은 배율로 표시되며 확대된 삽입물은 마커에 대해 양성인 세포(빨간색 직사각형)를 보여줍니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

TME는 암 발병, 진행 및 치료 반응에 필수적인 역할을 합니다. 또한, TME에서 특정 종양 침윤 림프구 하위 집합의 밀도는 특정 유형의 암에 대한 예후 바이오마커 역할을 할 수 있습니다. 놀랍게도, TME의 세포 조성 외에도 종양의 공간적 특성은 종양의 생물학을 이해하고 잠재적인 예후 바이오마커를 식별하기 위한 개요를 제공할 수 있습니다^12,17.

수많은 면역 세포 집단이 전암 또는 항암 반응에 관여하기 때문에 이러한 세포와 서로 및 암세포와의 공간적 관계에 대한 더 나은 이해는 새로운 면역 치료 전략을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 이전 연구에서는 종양 내 및 주위 영역의 조직 구조와 종양 세포의 침습성 가장자리를 기반으로 TME 세포의 위치 및 공간 분포를 계층화했습니다^18,19. 지난 15년 동안 기술 발전으로 인해 공간 분산을 기반으로 한 개별 세포의 표현형 분석은 TME를 연구하고 종양 면역 요법을 위한 잠재적 바이오마커를 분류하기 위한 새롭고 영향력 있는 도구가 되었습니다. 멀티플렉스 IF 조직화학은 다수의 생물학적 마커를 동시에 추정할 수 있다²⁰.

올리고뉴클레오티드 접합 항체 전략과 유사하게, TME를 연구하기 위해 발색, 형광, DNA 바코드 및 금속 동위원소 표지 항체 검출 시스템의 4가지 유형의 단백질 기반 멀티플렉스 플랫폼이 사용됩니다. 비용 효율적인 발색 IHC 플랫폼은 기존의 명시야 현미경을 사용하여 전체 슬라이드 시각화 및 병리학적 평가를 가능하게 합니다. 다중화된 IF 및 IHC에서는 형광단과 접합된 항체가 사용됩니다. 멀티플렉스 IF/IHC 플랫폼은 높은 특이성을 가진 항체를 검출하고 세포 내 수준에서도 표적 항체를 정량화할 수 있습니다 ^6,21. 또한 발색물질과 형광단의 특성으로 인해 하나의 항체 패널을 사용하여 단일 슬라이드에서 최대 10개의 바이오마커 발현을 캡처할 수 있습니다. 금속 동위원소 기반 플랫폼에서, 금속 태그된 항체는 단일 세포 및 공간 분해능으로 다중화 이미징을 수행하고, 개별 조직 절편에 대해 높은 감도를 나타내는데 사용된다²². 이론적으로 이러한 금속 접합 항체 접근법을 통해 단일 조직 섹션에서 100개 이상의 바이오마커를 동시에 검출할 수 있습니다. 동위원소 표지 기술의 한 가지 과제는 100% 농축 순도에 도달하는 것을 방지하는 동중원소 간섭이다²³. 또한 마커 수가 증가함에 따라 간섭이 증가합니다. DNA 접합 항체 검출 플랫폼은 고유한 DNA 바코드로 표지된 항체를 인식합니다. 40개 이상의 바이오마커가 이러한 플랫폼에서 높은 특이성으로 동시에 캡처될 수 있습니다⁶.

멀티플렉스 이미징은 DNA 결합 항체를 단일 조직 슬라이드에 한 번에 적용할 수 있는 상용 DNA 바코드 라벨 항체 검출 플랫폼입니다(그림 8). 조직 준비 단계의 경우, 제조업체에서 구입한 금 코팅 슬라이드를 사용해야 하는 다중화 이온빔 이미징 플랫폼과 달리 다중화 이미징 플랫폼은 조직이 염색 및 이미징 과정에서 조직을 온전하게 유지하기 위해 0.1% 폴리-L-라이신으로 코팅된 일반 커버슬립 또는 슬라이드만 필요합니다. 절편 후 4주 이내에 커버슬립에 조직 절편을 사용하는 것이 권장되며, 염색되지 않은 슬라이드를 장기간 보관하면 항원성이 감소합니다. 염색된 커버슬립 샘플은 염색 신호를 잃지 않고 최대 2주 동안 4°C의 보관 완충액에 보관할 수 있습니다. 커버슬립 샘플을 보관하는 데 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 다중화 이미징 시스템은 커버슬립 대신 일반 슬라이드를 사용하도록 업그레이드되어 더 큰 조직을 염색하고 쉽게 다룰 수 있습니다. 항체 접합을 위해 환원 용액을 사용하는 경우(단계 3.2.3), 반응은 항체 손상을 방지하기 위해 30분 이하로 제한되어야 합니다. 5.6.6단계의 차단 버퍼는 새로 준비해야 하며 차단 버퍼를 다시 사용해서는 안 됩니다.

발색, 형광 및 금속 동위원소 표지 다중화 항체 검출 플랫폼과 비교할 때 다중화 이미징 기술에는 특정 장점이 있습니다. 예를 들어, 다중화 이미징을 위해 60개 이상의 사전 설계된 항체 패널이 상용화되어 있어 항체 접합 및 검증에 드는 시간과 비용을 절약할 수 있으며 사전 설계된 항체 패널의 수가 증가하고 있습니다. 암종 마커 범사이토케라틴, 흑색종 마커 SOX10, 혈관 마커 CD31, 기질 마커 SMA 및 수많은 면역 세포 마커를 포함하는 이러한 항체는 검증되고 실험 준비가 되어 있습니다. 사전 설계되지 않은 항체의 경우, 다중화 이미징과 함께 사용하도록 설계된 상용 접합 키트는 간단하고 사용자 친화적입니다. 고객 접합 항체는 4°C에서 보관할 때 1년 동안 유효합니다. 또한 이미지를 캡처하기 위해 기계 예열이 필요하지 않습니다. 이러한 다중화된 이미징 기술에서, 이미지 획득에서 반복적인 세척, 혼성화 및 스트리핑 단계는 마커 강도의 감소 또는 조직 형태 저하를 거의 초래하지 않는다 5,24,25. 또한 합성 이미지는 간단한 3색 형광 현미경을 사용하여 QPTIFF 형식으로 캡처되며 타사 디지털 분석 소프트웨어를 사용하여 업로드 및 분석할 수 있습니다. 염색 마커는 단일 세포 분해능으로 시각화할 수 있으며, 마커의 공동 국소화를 통해 세포 표현형을 특성화할 수 있습니다(그림 6 및 그림 7). 다중화된 이미지의 포괄적인 분석을 통해 조직 구획, 단일 세포 마커 정량화, 최근접 이웃 및 근접 데이터를 추가로 확인할 수 있습니다(그림 8).

다중화 이미지 분석의 과제는 세포 유형 식별입니다. 일반적으로 더 많은 단일 개체 분류자가 이미지에 적용되면 더 흔하지 않은 표현형에 주석이 추가됩니다. 따라서, 동일한 분류자에서 공동-발현되지 않는 공지된 마커를 사용하고, 단일 세포의 주석에 표현형 관련 분류자만을 적용하는 것이 권장된다. 세포 유형 주석의 변화는 세포 공간 분포 및 세포 이웃 분석의 차이와 같은 실질적으로 다른 공간 결과를 초래할 것입니다^26,27.

멀티플렉스 이미지 분석은 FFPE 조직, 신선 냉동 조직, 보관된 전체 슬라이드 및 조직 마이크로어레이를 포함한 많은 샘플 유형을 염색하고 이미징하는 데 성공적인 것으로 입증되었습니다. 유방, 뇌, 폐, 비장, 신장, 림프절 및 피부 조직 절편의 다중화된 이미지는 심층 단일 세포 공간 표현형 데이터 ^5,16,25,28로 획득할 수 있습니다.

미래에는 다중화 이미징을 위해 미리 설계된 항체가 더 많이 나올 것으로 예상됩니다. 또한 다중화 이미지 분석을 위한 특정 소프트웨어의 개발이 절실히 필요합니다. 현재, Hi-Plex 이미지 분석을 위한 많은 상업적으로 이용 가능한 오픈 소스 소프트웨어 프로그램이 존재하지만²⁹, 과학자들은 여전히 이러한 분석을 위한 표준 워크플로우를 만드는 데 도움이 필요하다^(30,31). 이 프로토콜을 사용하여 캡처한 합성 이미지는 타사 소프트웨어와 호환되지만 사용자에게 추가 비용이 발생할 수 있습니다. 다중화 이미징 기술의 또 다른 단점은 반복적인 세척, 혼성화 및 대형 항체 패널과의 스트리핑 후 핵 단백질 검출의 신호 감소입니다. 다행스럽게도 리포터 플레이트를 설계할 때 초기 주기에서 바코드화된 형광단을 검색하면 이를 최소화할 수 있습니다. 최근에, 이 플랫폼은 새로운 고속 스캐닝 시스템으로 업그레이드되어, 합성 이미지⁽³²)를 획득하는 시간을 극적으로 감소시켰다. 또한, 티라미드 접합 바코드를 사용하는 새로운 전략이 올리고뉴클레오티드 접합 항체 바코드 기반 이미징을 향상시키는 것으로 보고되었습니다. 이 기술은 바코드 접합 항체를 얻기 어려운 염색 신호를 증폭하는 것을 목표로 한다³³.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x AR9 Buffer	Akoya Biosciences	AR900250ML
10x Buffer	Akoya Biosciences	7000001
16% paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	28906
1X Antibody Diluent/Block	Akoya Biosciences	ARD1001EA
Antibody Conjugation Kit	Akoya Biosciences	7000009	Contains Filter Blocking Solution, Antibody Reduction Solution 1, Antibody Reduction Solution 2, Conjugation Solution, Purification Solution, Antibody Storage Solution
Assay Reagent	Akoya Biosciences	7000002
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	40718-25ML
Dimethyl sulfoxide	Avantor/VWR	BDH1115-4LP
Ethanol, 200 proof
G Blocker V2	Akoya Biosciences	240199
Histoclear	Thermo Fisher Scientific	50-329-50
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Milli-Q Integral 10	Millipore	ZRXQ010WW
Niknon Fluorescence microscope	Keyence Corp. of America	BZ-X810
Nuclear Stain	Akoya Biosciences	7000003
Nuclease-free water	Thermo Fisher Scientific	AM9938
NuPAGE	Thermo Fisher Scientific	NP0008
PBS	Thermo Fisher Scientific	14190136
PhenoCycler Barcodes/Reporters Combination	Akoya Biosciences	5450004 (BX025/RX025)
		5450003 (BX022/RX022)
		5450023 (BX002/RX002)
		5250002 (BX020/RX020)
		2520003 (BX023/RX023)
		5250005 (BX029/RX029)
		5250007 (BX035/RX035)
		5250012 (BX052/RX052)
		5550012 (BX030/RX030)
		5550015 (BX042/RX042)
		5550014 (BX036/RX036)
QuPath	Open-Source	https://qupath.github.io/
SimplyBlue SafeStain	Thermo Fisher Scientific	LC6065
Staining Kit	(Akoya Biosciences	7000008	Contains Hydration Buffer, N Blocker, J Blocker, S Blocker, Fixative Reagent, Storage Buffer