조혈 줄기 및 전구 세포에 대한 유세포 분석을 통한 친족, 분열 수 및 표현형의 동시 평가

요약

여기에 제시된 것은 세포 분열 수, 표면 세포 표현형 및 세포 친족 관계를 동시에 측정할 수 있는 유세포 분석 기반 기술입니다. 이러한 속성은 순열 기반 프레임워크를 사용하여 통계적으로 테스트할 수 있습니다.

초록

동일한 세포에 대한 표현형과 운명을 동시에 평가할 수 있는 기술은 거의 없습니다. 표현형을 특성화하는 데 사용되는 현재 프로토콜의 대부분은 대규모 데이터 세트를 생성할 수 있지만 관심 세포의 파괴를 필요로 하므로 기능적 운명을 평가할 수 없습니다. 따라서 조혈과 같은 이질적인 생물학적 분화 시스템은 설명하기 어렵습니다. 세포 분열 추적 염료를 기반으로 우리는 많은 단일 조혈 전구체에 대한 혈연 관계, 분열 수 및 분화 상태를 동시에 결정하는 프로토콜을 추가로 개발했습니다. 이 프로토콜은 다양한 생물학적 공급원으로부터 분리된 쥐 및 인간 조혈 전구체의 생체 외 분화 가능성을 평가할 수 있습니다. 또한 유세포 분석과 제한된 수의 시약을 기반으로 하기 때문에 비교적 저렴한 방식으로 단일 세포 수준에서 많은 양의 데이터를 빠르게 생성할 수 있습니다. 또한 강력한 통계 프레임워크와 결합된 단일 세포 분석을 위한 분석 파이프라인을 제공합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 세포 분열과 분화의 연결을 허용하기 때문에 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 자가 재생과 분화 사이의 균형, 주어진 약속 운명에 대한 분열 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 전체적으로, 이 프로토콜은 단일 세포 관점에서 조혈 전구체 간의 생물학적 차이를 밝히는 것을 목표로 하는 실험 설계에 사용할 수 있습니다.

서문

지난 10년 동안 세포 및 분자 생물학에 대한 단일 세포 접근법이 전 세계적으로 확산되었습니다. 단세포 유전체학^1,2의 단계에 따라 오늘날에는 매년 급증하는 새로운 단세포 오믹스 기술을 통해 단일 세포의 많은 구성 요소(예: DNA, RNA^, 단백질)를 연구할 수 있습니다. 이러한 기술은 면역학, 신경생물학, 종양학 등의 분야에서 인간과 모델 유기체 세포를 사용하는 오래된 질문과 새로운 질문을 제시해 주었다³. 개별 세포 간의 차이점을 강조함으로써 단일 세포 오믹스는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)의 이질성을 중심으로 하고 분리된 동종 집단의 고전적 모델에서 벗어나 조혈의 새로운 모델의 정의를 촉발했습니다 ^4,5.

모든 오믹스 기법의 몇 가지 단점 중 하나는 관심 있는 세포가 파괴되어 기능을 평가할 수 없다는 것입니다. 반대로, 단일 세포 이식 분석 및 혈통 추적 기술과 같은 다른 단일 세포 방법은 생체 내에서 개별 세포의 운명을 평가함으로써 조상 세포의 기능에 대한 판독을 제공합니다 ^6,7. 혈통 추적 기술은 관심 있는 세포에 유전적 유전자 라벨(heritable genetic label⁾⁷ 또는 형광 라벨(fluorescent label)^8,9을 붙여서 여러 단일 세포의 운명을 동시에 추적할 수 있도록 하는 것이다. 그러나, 출발 세포의 특성화는 전형적으로 유세포 분석에 의해 평가된 몇 가지 표면 단백질의 발현과 같은 제한된 수의 파라미터로 제한된다¹⁰. 또한 단일 세포 계통 추적 기술은 일반적으로 DNA/RNA 시퀀싱 또는 이미징을 통해 세포 라벨을 힘들게 검출해야 합니다. 특히 이 마지막 점은 단일 실험에서 테스트할 수 있는 조건의 수를 제한합니다.

단일 세포의 기능을 연구하는 데 사용되는 또 다른 종류의 방법은 단일 HSPC의 생체 외 세포 배양 시스템입니다. 수행하기 쉬운 이러한 골드 스탠더드 분석에는 개별 세포를 96웰 세포 배양 용기로 분류하고 배양 후 일반적으로 유세포 분석 또는 형태학적 분석을 통해 세포 자손 표현형을 특성화하는 작업이 포함됩니다. 이들 분석은 주로 HSPC의 성숙 세포로의 장기 분화를 특성화하기 위해 사용되어 왔으며, 전형적으로 배양 2-3주 후에^{이루어졌다 11,12}. 대안적으로, 이들은 인간 줄기 세포 이식에 대한 의학적 이점을 약속하면서 생체 외 HSPCs 13,14,15,16,17,18을 유지하고 확장하는 데 사용되어 왔다 ¹⁹. 마지막으로, 그들은 단기 배양²⁰을 사용하여 HSPC의 초기 투입을 연구하는 데 사용되었으며, 이 배양에서 생성되는 적은 수의 세포가 주요 제한 요인입니다. 이러한 다양한 종류의 생체 외 분석의 한 가지 단점은 생체 내 복잡성을 부분적으로만 반영한다는 것입니다. 그럼에도 불구하고 그들은 인간 HSPC 분화를 연구하는 드문 방법 중 하나입니다.

기존의 단일 세포 방법(단일 세포 오믹스, 계통 추적 및 생체 외 배양)에서 누락된 정보 중 하나는 HSPC 역학²¹을 연구할 때 고려해야 할 필수 매개변수인 세포 분열의 정확한 감지입니다. 유세포 분석을 통해 분열 수를 평가하는 간단한 방법은 5-(및 6)-카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)²²와 같은 가용성 "단백질 염료"를 사용하는 것입니다. 이러한 분열 염료는 염색된 세포의 세포질 내부로 확산되고 절반으로 희석되어 모든 세포 분열에서 두 딸 세포로 전달되어 최대 10개의 분열을 열거할 수 있습니다. 여러 분할 염료를 결합하면 각 개별 염료가 서로 다른 자손을 분리 할 수 있기 때문에 동일한 우물에 여러 개의 개별 전구체를 뿌릴 수 있습니다. 이것은 쥐 림프구에 처음 도입된 다중 클론 및 분열 추적을 위한 세포 염료 사용의 원리입니다^23,24.

여기에서는 쥐 및 인간 HSPC와 함께 사용하기 위한 MultiGen 분석의 개발을 제시합니다. 이를 통해 생체 외에서 분화, 분열 및 친족 관계에 대해 많은 단일 세포를 동시에 테스트할 수 있습니다. 이 고처리량, 수행하기 쉽고 저렴한 분석을 통해 세포 표현형, 수행된 분열 수, 웰의 다른 세포와의 세포 친족 관계 및 클론 관계를 동시에 측정할 수 있습니다. 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 자기 갱신과 차별화 사이의 균형, 주어진 헌신 운명에 필요한 분할 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 형광 활성화 세포 분류기(FACS)와 플레이트 리더가 있는 유세포 분석기, 그리고 세포 배양을 수행하는 데 필요한 장비가 필요합니다. 인간 HSPC에 대한 분석 실행을 위한 기술 프로토콜 외에도 세포 패밀리²⁵의 개념과 관련된 세포 특성을 평가하는 데 필요한 통계적 테스트를 포함하여 상세한 분석 프레임워크를 제공합니다. 이 프로토콜은 이미 뮤린 HSPC 격실^{26, 27}을 기술하는데 성공적으로 사용되었다.

하기 프로토콜은 자기적으로 농축된 CD34⁺ 세포를 출발 물질로서 사용한다²⁸. 이러한 방식으로, 상이한 혈액 공급원 (예를 들어, 제대혈, 골수, 말초 혈액)으로부터 인간 HSPC를 효율적으로 염색하고 단리할 수 있다. CD34^- 분획은 상이한 유형의 실험 대조군을 설정하기 위한 프로토콜의 일부로서 사용될 것이기 때문에 폐기하지 않는 것이 중요하다. 언급된 세포의 양과 부피는 실험 작업 흐름과 필요에 따라 확장 또는 축소할 수 있습니다. 유사하게, 이 프로토콜은 세포 분류 및 유세포 분석 단계에 사용되는 항체를 간단히 수정함으로써 다양한 유형의 전구체 연구에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜의 경우 식별되지 않은 제대혈을 HSPC 공급원으로 사용하고 Saint-Louis Hospital 제대혈 바이오뱅크(승인 AC-2016-2759)에서 정의한 지침 및 헬싱키 선언에 따라 수집했습니다.

알림: 시작하기 전에 재료 표 에 나열되고 프로토콜에 언급된 대로 이 프로토콜에 필요한 모든 시약과 장비를 사용할 수 있는지 확인하십시오. 관련 시약을 신선하게 준비하고 명시적으로 언급되지 않는 한 보관하지 마십시오.

1. 세포 염료 염색

참고: 이 섹션에서는 CFSE와 바이올렛 염료(CTV) 세포 분열 염료의 4가지 조합을 사용한 염색에 대해 설명합니다. 세포 염료 용액이 첨가되지 않은 경우에도 모든 튜브를 동시에 처리합니다. 모든 단계는 다음 세포배양 단계가 가능하도록 멸균 조건에서 수행된다. 소요 시간: 약 100분

1. 제대혈 유닛을 자기 분류 프로토콜⁽²⁹)에 따라 처리한다. 큰 CD34^- 분획과 더 작은 CD34⁺ 분획의 두 가지 분획을 사용할 수 있는지 확인합니다. 두 튜브를 300 x g에서 5분 동안 돌립니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다.
2. CD34⁺ 분획의 경우 소 태아 혈청(FBS)이 없는 Dulbecco's modified Eagle 배지(DMEM) 1mL에 재현탁합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고; 세포 밀도는 3 x 10⁶ cells/mL보다 높아서는 안 됩니다. 이 경우 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. CD34^- 분획의 경우 FBS 없이 DMEM에서 재현탁하고 부피를 최대 6 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.
3. CD34⁺ 분획 250μL를 15mL 폴리프로필렌 튜브 4개에 분취합니다. CD34⁺/CF(CFSE_only), CD34+/CV(CFSE_high CTV_low), CD34+/VC(CFSE_low CTV_high) 및 CD34⁺/VI(CTV_high)와 같이 튜브에 라벨을 붙입니다. CD34^-분획 250 μL를 또 다른 4개의 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 분취한다. CD34^-/CF(CFSE_only), CD34-/CV(CFSE_high CTV_low), CD34-/VC(CFSE_low CTV_high) 및 CD34^-/VI(CTV_high)와 같이 튜브에 라벨을 붙입니다. CD34^-분획으로부터의 나머지 세포는 폐기될 수 있다.
4. CFSE_high 및 CFSE_low라는 두 가지 CFSE 솔루션을 준비합니다. CFSE_high(10μM)의 경우 FBS가 없는 DMEM 1.1mL와 CFSE 스톡 2.2μL(5mM) 용액을 혼합합니다. CFSE_low(5 μM)의 경우 FBS가 없는 DMEM 550 μL와 CFSE 스톡 (5 mM) 용액 0.55 μL를 혼합합니다.
5. CFSE_high 용액 250 μL를 CF 및 CV 튜브에, CFSE_low 용액 250 μL를 VC 튜브에, DMEM 250 μL(FBS 미포함)를 VI 튜브에 추가합니다. 세포 현탁액과 세포 염료의 효율적인 혼합을 보장하기 위해 튜브를 거의 90도 기울이고 CFSE 용액을 튜브 벽에 증착하십시오. 그런 다음 튜브를 수직으로 잡고 두 용액을 혼합하고 CFSE 용액과 재현탁 셀이 빠르게 혼합되도록 3-4회 피펫팅합니다. 37°C에서 정확히 8분 동안 배양합니다.
6. 배양 후 5mL의 DMEM + 10% FBS를 추가합니다. 튜브를 37°C에서 5분 동안 유지합니다.
7. 300 x g에서 5분 동안 튜브를 돌립니다. 펠릿을 방해하지 않고 흡인을 통해 상청액을 제거하고 5mL의 인산염 완충 식염수 1x/에틸렌디아민테트라아세트산(PBS 1x/EDTA)으로 펠릿을 세척합니다. 300 x g에서 5분 동안 다시 돌립니다. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리고 250μL의 1x PBS/EDTA에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
8. CTV_high와 CTV_low라는 두 가지 CTV 솔루션을 준비합니다. CTV_high(10μM)의 경우 PBS 1x/EDTA 1.1mL와 CTV 스톡 2.2μL(5mM)를 혼합합니다. CTV_low(5 μM)의 경우 550 μL의 PBS 1x/EDTA와 0.55 μL의 CTV 스톡(5 mM)을 혼합합니다.
9. CTV_high 용액 250 μL를 VC 및 VI 튜브에, CTV_low 용액 250 μL를 CV 튜브에, 250 μL의 1x PBS/EDTA를 CF 튜브에 추가합니다. 1.5단계에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용합니다. 37°C에서 정확히 8분 동안 배양합니다.
10. 배양 후 5mL의 DMEM + 10% FBS를 추가합니다. 37°C에서 5분간 보관합니다.
11. 300 x g에서 5분 동안 튜브를 돌리고 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버린 다음 5mL의 1x PBS/EDTA로 펠릿을 세척합니다. 300 x g에서 5분 동안 다시 돌립니다.
12. 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 버리고 CD34^- 분획을 1x PBS / EDTA에서 1.5 x^{10 6} cells/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. CD34⁺ 분획을 40μL의 염색 완충액에 재현탁하고 세포를 1.5mL 튜브에 옮깁니다.

2. 항체 염색

참고: 항체 염색은 실험 요구에 따라 맞춤화할 수 있습니다. CD34⁺ 분획만 항체 염색을 거칩니다. CD34^- 분획은 세포 분열 염료 조합물 (CV, VC, CF, 및 VI 분획)에 대한 단일 염색 대조군으로서 사용된다. 다음 패널은 조혈 줄기 세포(HSC), 다분화능 전구세포(MPP), 림프 프라이밍 다능성 전구세포(LMPP) 및 조혈 전구 세포(HPC)의 4가지 유형의 HSPC 검출에 맞게 조정되었습니다¹². 그러나 HSC 및 MPP의 식별이 제시됩니다. 소요 시간 : 75 분.

1. 보상 비드를 사용하여 표면 염색을 위한 단일 염색을 준비합니다. 음성 비드와 면역글로불린 G(IgG) 비드를 1:1 비율로 혼합하여 총 부피 20μL x 표면 마커 수(예: 염색 패널에 6개의 항체가 포함된 경우 120μL)에 해당합니다.
2. 각 마커에 대해 20μL의 비드를 개별 1.5mL 튜브에 분배합니다. 해당 튜브에 각 항체의 희석 인자에 해당하는 부피를 추가합니다(예: 희석 계수가 1:20인 경우 1μL 추가).
3. CD34⁺ 세포를 염색하기 위해, 표 1에 기초하여 항체¹²의 마스터 믹스를 준비한다. 항체를 단일 0.5mL 튜브에 혼합합니다. 항체 마스터 믹스의 7 μL를 4 개의 CD34 + 조건 각각에 추가하십시오.
4. 보상 비드와 CD34⁺ 샘플을 4°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.
   참고: 배양 시간은 염색에 사용되는 항체의 기술적 세부 사항에 맞게 조정되어야 합니다.
5. 배양하는 동안 분류에 사용할 96웰 둥근 바닥 플레이트를 준비하고 다채널 피펫을 사용하여 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다.
   알림: 웰 H8-H12를 비워 두십시오.
6. 표면 염색 대조군(5, 비드 사용), 세포 분열 염료 대조군(4, CD34^- 분획 사용) 및 CD34⁺ 샘플(4)에 대한 라벨 5mL 폴리프로필렌 튜브.
7. 배양이 끝나면 세포와 비드를 1mL의 염색 완충액으로 세척합니다. 총 부피를 5mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다. 5 x g에서 300분 동안 튜브를 원심분리한 다음 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다.
8. 비드 및 CD34⁺ 세포에 대해 각각 약 500 μL를 사용하고, CD34^- 튜브에 대해 1 mL를 사용하여, 염색 완충액에 세포를 재현탁시킨다.

표 1: 세포 분류 실험을 위한 항체 마스터믹스를 제조하기 위한 템플릿. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 세포 분류

알림: 정렬된 셀 번호는 사용 가능한 총 셀 수에 따라 달라질 수 있습니다. 프로토콜에서는 각 컨트롤에 대한 최소 셀 번호가 제공됩니다. 소요 시간(1판 1개): 100분

1. 템플릿 실험을 열거나 새 실험을 설정합니다. 단일 시편과 여러 튜브를 각 조건마다 하나씩 생성합니다.
2. 그림 1에 자세히 설명된 게이팅 전략을 설정하여 6개의 도트 플롯 다이어그램을 만듭니다. 먼저 FSC-A/SSC-A 도트 플롯에서 셀을 시각화하고 다각형 게이팅 도구를 두 번 클릭하여 측면 산란이 낮은 모집단을 선택합니다(그림 1A). 다음 도트 플롯(FSC-A/FSC-H)에서 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 "셀" 게이트를 클릭하여 선택합니다. 동일한 게이팅 도구를 사용하여 두 축 사이의 대각선에서 좁은 모집단을 선택합니다(그림 1B).
3. 세 번째 점도표(APC 대 FSH-H)에서 모집단 "단일 세포"를 표시하고 APC 계통(Lin)의 발현에 대해 음성인 세포를 게이트합니다(그림 1C). 네 번째 플롯(CFSE 대 CTV)에서 모집단 "Lin^-"을 표시하고 각 염료 조합에 대해 하나씩 4개의 분리된 게이트를 만듭니다(그림 1D).
   참고: 이 게이트는 균질하게 염색된 세포의 작은 부분만 선택하기 위해 단단해야 합니다.
4. 다섯 번째 및 여섯 번째 플롯(APC-Cy7 대 BV650 및 PE-Cy7 대 PE)을 사용하여 관심 있는 전구체를 식별합니다. 다섯 번째 그림에서 CD34+CD38^- 모집단과 CD34+CD38⁺를 관대하게 게이트합니다(그림 1E). 그런 다음 그림 1F에 따라 여섯 번째 플롯에서 CD34⁺CD38^- 모집단을 선택하고 세 개의 게이트를 그립니다.
5. 보정 비드가 포함된 단일 염색 튜브를 실행하고 Acquire 버튼을 클릭합니다. 매개변수 드롭다운 메뉴에서 광전자 증배관(PMT) 전압, 특히 세포 분열 염료(이지수 척도에서 10⁴ 에서 10⁵ 사이)를 조정합니다.
6. 보정(Compensation) 탭을 사용하여 정렬에 사용되는 패널에 맞게 보정 매트릭스를 구체화합니다. 비드 게이트에 최소 5,000개의 이벤트를 기록하고 기록 버튼을 클릭합니다.
7. CD34^- 분획을 실행하고 보상 매트릭스를 다시 확인합니다. 단일 셀 게이트에 최소 10,000개의 이벤트를 기록합니다 .
8. CD34⁺ 분획을 실행하여 단일 세포 게이트에 최소 5,000개의 이벤트를 기록합니다. 각 염료 조합에 대한 게이트를 조정하고 균질한 모집단을 선택하기 위해 단단한 게이트를 설정합니다(그림 1D). 마찬가지로 HSC 및 MPP를 선택하기 위한 게이팅을 조정합니다.
9. 분석이 완료되고 모든 튜브가 기록되면 96웰 플레이트에서 분류하기 위한 표준 Aria 보정을 수행한 후 플레이트를 적절한 홀더에 삽입합니다. 플레이트를 냉각하는 것이 좋습니다.
10. 실험 정렬 레이아웃을 사용하여 표 2에 제시된 계획에 따라 플레이트 분류 템플릿을 준비합니다. "CD34^-"라는 이름의 웰에는 CF/CV/VC/VI 게이트에 분류된 5,000-10,000개의 세포가 포함되어 있습니다. "벌크" 웰에는 게이트 CD34⁺CD38^-에 분류된 최소 500개의 세포가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 단세포 웰은 웰 당 세포 분열 염료 조합 당 하나의 이벤트만을 함유하므로 웰 당 총 4개의 이벤트를 포함한다.
    참고: "대량" 모집단은 특정 선조의 하위 집합에 맞게 조정할 수 있습니다. 500개 미만의 셀을 정렬하지 마십시오.
11. 분류를 위해 순서대로 진행하여 다음 단계로 이동하기 전에 모든 세포 분열 염료 조합을 완료합니다. 예를 들어, 수율 순도 모드에서 CD34-CF를 분류하는 것부터 시작합니다. 획득 버튼을 클릭한 다음 정렬 버튼을 클릭합니다.
12. CD34^- 분류가 끝나면 CF CD34⁺ 튜브를 삽입합니다. 획득한 다음 정렬 버튼을 클릭하고 순도 등급으로 0/ 16/0 을 선택했는지 확인합니다. 마지막으로, 관심 있는 셀을 단일 세포 순도로 웰당 하나의 셀로 정렬하고 Index Sorting 옵션을 선택해야 합니다.
13. 다음 세포 분열 염료 조합으로 이동하여 동일한 순서를 반복하십시오. 참고로, 표 2 는 분류된 플레이트의 예를 제공한다.
    참고: 인덱스 정렬 기능은 정렬된 각 조건에 대한 개별 파일을 생성합니다.
14. 정렬이 끝나면 파일을 .fcs 3.0 파일로 내보냅니다. 세포를 37°C, 5%_CO2 배양기에 넣는다. 세포는 실험 설계에 따라 적어도 24시간²⁶일 동안 여러 날 동안 배양됩니다.

표 2: 연속 유세포 분석을 위한 특정 요구 사항을 기반으로 한 세포 분류 96웰 플레이트용 템플릿. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

4. 세포 분류 데이터 분석

참고: 세포 분류의 품질을 검증하려면 더 진행하기 전에 FACS 데이터 분석이 필요합니다. 이 단계의 주요 출력은 정렬된 각 개별 셀의 마커 강도를 포함하는 스프레드시트를 생성하는 것입니다.

1. 분석 소프트웨어에서 .fcs 3.0 파일을 업로드합니다.
2. 실제 정렬 전에 기록된 단일 염색 파일을 사용하여 세포 분류 중에 사용된 보정 설정을 확인합니다.
3. 다른 벌크에 해당하는 파일을 사용하여 수정된 게이팅 전략을 설정합니다. 해당 게이트를 복사하여 인덱스 정렬 파일에 붙여넣습니다.
4. 인덱스 정렬 셀이 설정된 게이트에 떨어졌는지 확인합니다. 잘못 게이트된 일부 정렬된 셀이 있는 경우 인덱스 정렬 중에 기록된 플레이트 좌표를 내보내 식별할 수 있으며 나중에 분석에서 제거할 수 있습니다.
5. 인덱스 정렬 파일에서 이벤트를 보정된 매개 변수로 내보냅니다. .csv 파일로 내보내고 "scale values" 및 "compensated parameters" 옵션을 선택합니다. 이러한 파일은 "내보낸 파일"이라는 폴더에 내보내야 합니다.
6. 추가 파일 1의 스크립트를 사용하여 모든 파일을 단일 .csv 파일로 결합합니다. "setwd"함수로 올바른 경로를 설정하십시오. 이 스크립트의 출력은 서로 다르게 제어된 모든 이벤트와 모든 매개변수에 대한 상대적 강도를 포함하는 스프레드시트입니다.

5. 배양 후 항체 염색

참고: 프로토콜의 이 부분을 무균 상태에서 수행하십시오. 여러 시약은 이전 단계와 공유되며 멸균 상태를 유지해야 합니다. 유세포 분석 분석의 경우 플레이트 리더가 있는 유세포 분석기를 사용하십시오. 이를 통해 조직 배양 플레이트에서 직접 염색을 수행할 수 있으며, 피펫팅 및 방사의 양을 제한하여 세포 손실을 최소화할 수 있습니다. CF/CV/VC/VI 색상에 대한 단일 염색을 나타내고 96-웰 플레이트에 이미 존재하는 웰 A1-A4를 제외하고 보상 비드를 사용하여 표면 마커 단색 염색을 준비합니다. 세포 염료에 따라 분류된 벌크 모집단은 분열 수와 일반 게이팅에 대한 게이팅 전략을 설정하는 데 도움이 됩니다. 소요 시간 : 120 분.

1. 프로토콜을 시작하기 전에 도립 현미경으로 플레이트를 확인하여 적어도 하나의 세포가 포함된 웰을 표시합니다. 이 단계를 통해 염색에 사용되는 항체의 양을 최적화하고 절차를 가속화할 수 있습니다.
2. 표 3에 따라 항체 마스터믹스를 제조한다. 상당한 양의 피펫팅이 있기 때문에 표는 추가 5% 부피를 포함하여 피펫팅으로 인한 기술적 오류를 고려합니다. 상기 표에 기재된 항체는 인간 제대혈 샘플로부터 다양한 HSPC를 특성화할 수 있게 한다¹².
3. 플레이트를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 후드 아래와 종이 타월 위에 플레이트를 빠르게 뒤집어 상층액을 제거합니다.
4. 8 μL의 염색 완충액을 웰 A1-A4에 첨가한다. 혼합물 8μL를 다른 웰에 추가합니다.
5. 음성 비드와 IgG 보상 비드를 1:1 비율로 혼합하여 총 부피가 120μL에 해당합니다. 각 마커당 하나의 1.5mL 튜브에 20μL를 발송합니다. 희석 인자에 해당하는 항체 부피를 추가합니다(예: 희석 계수가 1:20인 경우 1μL 추가).
   참고: 염색에 사용된 마커 수에 맞게 총 부피를 조정합니다(예: 염색 패널에 5개의 항체가 포함된 경우 100μL).
6. 플레이트 및 단일 염색 보상 대조군을 +4°C에서 최소 30분 동안 배양합니다.
   참고: 배양 시간은 염색에 사용된 항체의 기술적 세부 사항에 맞게 조정되어야 합니다.
7. 1mL의 염색 완충액으로 비드를 세척합니다. 이전에 라벨이 붙은 5mL 폴리프로필렌 튜브에 총 부피를 옮깁니다. 튜브를 300 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음 흡인을 통해 상층액을 제거합니다.
8. 다채널 피펫을 사용하여 웰 당 100 μL의 염색 완충액을 첨가하여 플레이트에서 세포를 세척합니다. 플레이트를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 후드 아래와 종이 타월 위에 플레이트를 빠르게 뒤집어 상층액을 제거합니다.
9. 다중 채널 피펫을 사용하여 85μL의 염색 완충액에 세포를 다시 현탁합니다.
10. 유세포 분석기(수집 모드)에서 분석을 시작하고 전용 템플릿을 사용하고 사용자 지정을 클릭합니다. 이 맞춤형 템플릿은 96웰 원형 바닥 플레이트의 기술적 특징, 특히 각 웰의 치수(직경, 깊이 및 두께)를 고려합니다. 프로브는 우물의 바닥에 도달해야 하므로 우물 A1 및 H12의 정확한 중앙에 설정하십시오.
11. 소프트웨어에 의해 제안된 리스트로부터 관심있는 형광단 을 선택한 후, 표 2의 플레이트 템플릿에 따라 플레이트 설정을 설정하고, 하나 이상의 셀을 함유하는 웰의 수에 대해 보정하였다.
12. 획득 부피 한계로 100 μL를 선택합니다. 교반 옵션을 선택하십시오. 속도가 낮을수록 웰당 분석되는 총 부피가 향상되므로 획득 속도를 최대 1μL/s로 설정합니다.
13. 웰 H8-H12에 적절한 세척 및 세척 용액을 추가합니다. 표 2 의 템플릿은 특히 유세포 분석기가 분석이 끝날 때 다양한 세척 조건을 실행해야 하기 때문에 웰 H8-H12를 비워 둡니다.
    참고: 이 단계는 사용된 유세포 분석기의 특성에 맞게 조정됩니다.
14. 플롯 및 게이트 섹션에서 먼저 FSC-A/SSC-A 산점도를 사용하여 단일 셀 게이트를 설정한 다음 FSC-H/FSC-A 산점도를 설정합니다. 관심 있는 각 마커에 대한 히스토그램 을 만듭니다.
15. 설정이 확인되면 분석 섹션으로 진행합니다. 먼저 단일 염색을 분석하여, 보상 비드 및 CD34-염색된 분획 둘 다에 대해 5,000개 이상의 이벤트(최적 범위: 5,000-15,000 이벤트)를 기록 한다. 필요한 경우 전압을 조정하십시오.
16. 단일 염색이 모두 기록되면 획득 기능을 클릭하여 실제 획득 을 시작할 수 있습니다.

표 3: 유세포 분석 실험, 특히 인간 제대혈에서 HSPC를 식별하기 위한 항체 마스터믹스. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

6. 배양 후 유세포 분석 데이터 분석

참고: 설명된 데이터 분석은 재료 표에 언급된 소프트웨어에 따라 다릅니다. 주요 출력은 표면 마커 강도, 분할 수 및 분석된 각 셀당 친족 관계에 대한 정보가 포함된 스프레드시트를 생성하는 것입니다. 프로토콜의 이 부분에는 최종 분석 스프레드시트를 생성하기 위해 이 워크플로에 필요한 R로 작성된 스크립트가 포함되어 있습니다.

1. 유세포 분석기에서 파일을 .fcs 파일로 내보냅니다. 분석 소프트웨어에 업로드하여 "단일 염색", "벌크" 및 "단일 세포"로 그룹화합니다.
2. 단일 염색 파일을 사용하여 보정 매트릭스를 준비하고 드래그 앤 드롭으로 다른 두 그룹에 적용합니다.
   알림: 자동 보정 도구를 사용하는 경우 계속 진행하기 전에 수동으로 품질을 확인하십시오.
3. 대표 게이팅을 가지려면 서로 다른 벌크 웰을 단일 파일에 연결합니다. 이 단계에서는 두 색상이 겹치거나(일반적으로 CV 및 VC) 다른 이상 현상이 있는 경우 빠르게 강조 표시되므로 제외해야 합니다. 모집단 연결 옵션을 클릭한 후 "매개변수" 메뉴에서 보정되지 않은 모든 매개변수를 선택한 다음 연결을 클릭합니다.
4. 연결된 파일을 작업 공간에 업로드한 다음 드래그 앤 드롭을 통해 보정 매트릭스를 적용합니다.
5. 연결된 파일을 사용하여 그림 2 에 정의된 게이팅 전략을 준비합니다. 단일 셀 게이트에서 CFSE 및 CTV를 사용하여 산점도에 이벤트를 표시합니다. 4가지 색상을 모두 포함하고 가능한 자동 형광을 제외하고 Labeled라는 첫 번째 게이트를 만듭니다(그림 2C). 그런 다음 각 색상을 개별적으로 게이트합니다.
6. CV 및 VC로 라벨링된 셀은 색상이 CFSE 및 CTV 신호의 결과라는 점을 고려하여 변환된 값이 필요합니다. 따라서 두 개의 배위 신호는 로그 스케일에서 45° 회전하여 분할 희석이 x축과 평행하게 진행될 수 있도록 합니다. 이 변환된 값은 Tools(도구)를 클릭한 다음 Derive Parameter(매개변수 파생)를 클릭하여 수동으로 파생됩니다. 수식 상자에 다음 수식을 붙여 넣습니다.
   
   참고: 수식²⁶ 은 CFSE 및 CTV가 매개변수 03 및 17이라고 가정합니다.
7. 파생 매개변수(Derived Parameter)라는 새로운 매개변수를 올바르게 시각화하려면 ~ 3-7 범위의 선형 축을 설정하고 축 매개변수 옵션을 클릭하고 축 사용자 정의(Customize Axis)를 선택합니다.
8. 히스토그램 플롯으로 각 색상에 개별적으로 게이팅을 적용합니다: CF 및 VI의 경우 각각 x축에 CFSE-A 및 CTV-A 를 설정합니다. CV 및 VC의 경우 x축에 새로 파생된 매개변수를 설정합니다. 그림 3과 같이 각 피크에 해당하는 게이트를 설정합니다.
9. 각 개별 단일 셀 웰에 게이팅을 적용합니다. 파생된 매개 변수를 분석된 모든 웰에 추가해야 합니다. 각 웰에 대한 각 컬러 게이트를 수동으로 확인하여 지정된 피크에 잘못 할당된 이벤트를 감지합니다. 게이팅의 예는 그림 4에 나와 있습니다.
10. 분석이 완료되고 모든 웰이 확인된 후 하나 이상의 셀을 포함하는 모든 CF/CV/VC/VI 게이트를 선택합니다. .csv 파일로 내보내 고 "scale values" 및 "compensated parameters" 옵션을 선택합니다. 이러한 파일은 "내보낸 파일"이라는 폴더에 내보내집니다.
11. 추가 파일 1의 R 스크립트를 사용하여 모든 파일을 단일 .csv 결합합니다. "setwd" 함수를 사용하여 올바른 경로를 설정하는 것을 잊지 마십시오. 이 스크립트의 출력은 모든 다른 게이트 이벤트와 모든 매개변수에 대한 상대적 강도를 포함하는 스프레드시트입니다.
12. 스프레드시트를 열고 각 매개변수의 열 이름을 바꿉니다(예: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38 사용). 이러한 이름은 각 셀에 ID를 올바르게 할당하기 위해 게이팅 임계값을 식별하는 데 사용됩니다.
13. "Well", "Condition", "Color", "Generation", "Original_cell" 및 "Culture_time"라는 6개의 열을 추가합니다. 이러한 변수는 실험적으로 정의되고 각 행에서 유추되는 변수입니다.
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (웰), CD34 ⁺ (Original_cell), PBS (조건), CV (색), Peak_1 (생성).
14. 벌크 웰을 내보내 게이팅에 대한 임계값 식별: 보정된 관심 모집단(예: CD34⁺CD38^-)을 .csv 파일로 내보내고 "스케일 값" 및 "보정된 매개변수" 옵션을 선택합니다. 이러한 파일을 "내보낸 파일"이라는 폴더로 내보냅니다.
15. CD38에 대한 임계값을 찾으려면 이 매개변수에 대한 가장 큰 숫자 값을 식별합니다. 반대로, CD34에 대한 임계값을 찾으려면 이 매개변수에 대한 가장 작은 숫자 값을 식별합니다. 관심 있는 모든 매개변수에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
    참고: 프로토콜에 제시된 분석을 위해 마커 CD45RA는 CD34⁺CD38^- 게이트의 LMPP와 CD34⁺CD38⁺ 게이트의 CMP/GMP를 식별하는 데 모두 사용됩니다. 즉, 이 마커에 대해 두 개의 서로 다른 임계값을 추출해야 합니다.
16. 임계값을 복사하여 "gating_matrix"라는 Excel 파일에 붙여넣습니다. 이 파일은 표 4에 따라 구성되며 여러 개의 독립적인 실험을 분석할 수 있습니다. XXYYMMDD_xxh, 여기서 XX는 연산자의 두 이니셜, YY는 연도의 마지막 두 숫자, MM은 월, DD는 일, xx는 분석 시점을 나타냅니다.

표 4: 통계 분석 전의 세포 운명 할당을 위한 게이팅 매트릭스. CD45h는 HPC 서브세트 게이팅에 대한 CD45RA의 강도를 지칭하는 반면, CD45l은 CD34⁺CD38^- 서브세트에 대한 CD45RA의 강도를 지칭한다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

7. 통계 분석

참고: 생성된 데이터의 통계 테스트에는 프로그래밍 언어 Python(보충 파일 2, 보충 파일 3 및 보충 파일 4)을 사용하여 코딩된 맞춤형 분석 파이프라인이 포함됩니다. 스크립트는 스프레드시트 처리를 위한 첫 번째 블록, 데이터 시각화를 위한 히트맵을 생성하기 위한 두 번째 블록, 차별화 및 나눗셈 속성을 분석하고 테스트하기 위해 여러 히스토그램을 생성하는 마지막 블록의 세 가지 블록으로 구성됩니다.

1. 블록 "0_process_data"(보충 파일 2)에서 시작하여 gating_matrix 및 데이터 스프레드시트 경로가 스크립트에 올바르게 정의되어 있는지 확인합니다.
2. "cell_cols" 사전을 정의하여 각 셀에 관련 셀 운명을 할당합니다. 특정 경우에, 운명은 HSC, MPP, LMPP, 일반적인 골수 전구체 (CMP), 과립구-단핵구 전구체 (GMP), 거핵 세포-적혈구 전구 체 (MEP) 및 CD34^-입니다.
3. 벌크 웰(단계 6.16)에서 정의된 임계값을 사용하여 "cell_class_exp_time" 함수를 정의합니다. 6.12단계에서 각 컬럼을 정의하는 데 사용된 것과 동일한 이름을 사용하여 이러한 임계값을 올바르게 정의하려면 컬럼 이름 지정에서 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.
4. 세포 표현형은 유세포 분석 중에 검출된 임계값을 기반으로 일련의 "if-else" 문을 사용하여 스크립트에서 정의됩니다.
   참고: 다른 마커 조합을 수용하기 위해 이러한 명령문을 수정하여 다른 표현형을 표시할 수 있습니다.
5. 함수 "cond_rule"(예: 다른 실험 처리)을 사용하여 실험적 특정 조건을 지정합니다. 제공된 데이터 세트의 경우 조건의 이름은 "GT" 및 "Diff"입니다. 세포를 배양하는 데 사용되는 두 가지 다른 세포 배양 배지를 설명하십시오. 이 정보는 히트맵을 플로팅하기 위해 블록 "1_dot_plot"(보충 파일 3)에서 사용됩니다.
6. 블록 "2_bar_plot"(보충 파일 4)에서 관심있는 개별 셀 운명을 포함하여 사전 "class_dct"를 정의합니다. 제공된 데이터 세트의 경우 관심 있는 셀 운명은 "cell_cols" 사전에 설명된 것과 동일합니다.
7. "conds"(조건), "or_cells"(원래 셀), "sym_labs"(대칭 레이블) 및 "times"(실험 시점)를 정의합니다. 이는 플로팅에 필요한 필터를 반복합니다. "conds"는 "cond_rule"에 정의된 조건을 다시 취하고, "or_cells"는 HSC 및 MPP이며, "sym_labs"는 분할 유형을 나타냅니다.
8. 블록 "2_bar_plot"에서 분할 6까지 진행된 셀을 그릴 수 있습니다.
   참고: 제공된 데이터 세트에는 디비전 4까지의 셀만 포함되어 있으므로 오류 메시지가 표시되지만 스크립트가 작동하지 않는 것은 아닙니다.
9. 스크립트에 의해 생성된 그림은 "그림"이라는 폴더에서 pdf 파일로 검색할 수 있습니다. "Test"라는 파일은 해당 히스토그램에 대해 수행된 다양한 통계 테스트를 나타냅니다.

결과

FACS 분류
이 프로토콜에 제시된 정렬 게이팅 전략은 널리 인정되는 전략 12,30,31을 기반으로 합니다. 그림 1에 제시된 게이팅 전략의 경우, 출발 물질은 이전에 CD34⁺ 자기 농축을 통해 정제된 제대혈 전구체이며, 이는 리니지 양성 세포의 무시할 수 있는 비율을 설명합니다. 4가지 세포 내 염료 조합(예: 그림의 CTV)에 대해 tight gate를 사용하여 다음 분석 중에 피크의 분리능을 개선하고 올바른 세포 집단을 게이트하는 것이 필수적입니다(그림 1D). 그림에 표시된 경우 게이트는 가장 크고 더 잘 정의된 모집단을 선택합니다. 각 세포 분열 염료 조합에 대해 여러 개의 가까운 집단의 존재는 우리의 경험상 생물학적 차이를 대표하지 않습니다. 대신, a) 최적이 아닌 염색 절차 또는 b) 세포의 시작 풀에서 큰 이질성(특히 크기)을 나타낼 수 있습니다. 이것은 제대혈 또는 기타 복잡한 생물학적 공급원(예: 골수 흡인, 말초 혈액)에서 시작할 때 예상치 못한 일이 아닙니다. 게이트가 엄격하게 정의되지 않은 경우, 서로 다른 염료 조합의 점진적인 희석으로 인해 특히 CV 및 VC 조건에 대한 이후 피크가 병합될 수 있습니다(그림 2D). 차선의 게이팅의 또 다른 부정적인 결과는 이질적인 시작 집단이 얕은 피크로 이어질 수 있기 때문에 세포 배양 후 서로 다른 피크를 효율적으로 구별할 수 없다는 것입니다.

그림 1: 세포 분류를 위한 게이팅 전략. (A) FSC-A 대 SSC-A, 파편 및 오염 세포를 배제합니다. (B) FSC-A 대 FSC-H, 이중선 및 세포 덩어리를 제외합니다. (C) Lin 대 FSC-H, Lin+인 셀을 제외합니다. (d) CTV 대 CFSE, 염료 조합 CF, CV, VC 및 VI로 염색된 세포를 단목소리로 식별하기 위해. 게이트는 동질적인 인구를 포함할 수 있을 만큼 충분히 엄격해야 합니다. (E) CD34 대 CD38, 다능성 구획 CD34+CD38^-에서 제한된 전구체 CD34⁺CD38⁺(HPC라고도 함)를 분리합니다. (F) CD34+CD38- 집단에서 CD45RA 대 CD90은 HSC(CD90⁺CD45RA-), LMPP(CD90^중간CD45RA⁺) 및 더 헌신적인 MPP(CD90-CD45RA^-)가 풍부한 가장 미성숙한 전구체 사이를 분리합니다. (g) 이들의 세포 염료 조합 염색 및 (H) 표면 마커 CD90 및 CD45RA의 발현에 대해 여기에 표시된 인덱스 정렬 이벤트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 배양 후 유세포 분석
그림 2의 데이터는 다양한 골수 전구체 및 전구체를 지원할 수 있는 여러 사이토카인의 존재 하에 72시간 동안 배양된 인간 제대혈 HSC를 나타냅니다. 패널 2A 내지 2D는 각각의 개별 세포의 친족관계를 확립하는 데 필요한 게이팅을 나타내는 반면, 패널 2E 내지 2G는 세포 표현형을 허용한다. 그림에서 MEP의 감소된 존재는 아마도 이 대표적인 실험에 사용된 배양 조건의 결과일 것입니다(그림 2F). 상이한 사이토카인 및 배양 조건을 사용하면 실험을 위해 상이한 시작 세포를 선택하는 것과 유사하게 각 하위 집합의 상대적 백분율이 변경됩니다.

그림 2: 유세포 분석을 위한 게이팅 전략. (A) FSC-A 대 SSC-A, 파편 및 오염 세포를 배제합니다. (B) FSC-A 대 FSC-H, 이중선 및 세포 덩어리를 제외합니다. (C) CTV 대 CFSE, 게이트 라벨링은 데이터 분해능에 영향을 줄 수 있는 모든 자동 형광 이벤트를 배제할 수 있습니다. (D) CTV 대 CFSE. 세포 분열 염료 희석을 기반으로 4개의 집단을 엄격하게 검사하는 것이 매우 중요합니다. (E) 커밋된 전구체(CD34-), 제한된 전구체(HPC)(CD34+CD38⁺) 및 미성숙 전구체(CD34⁺CD38^-)를 구별하기 위한 CD34 대 CD38. (F) CD45RA 대 CD123, 세 가지 유형의 제한된 전구체를 구별하기 위해: CMP(CD123+CD45RA^-), MEP(CD123-CD45RA^-) 및 GMP(CD123⁺CD45RA⁺). (G) HSC, LMPP 및 MPP를 식별하기 위해 CD34⁺CD38^-에서 CD45RA 대 CD90. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

피크 정의 및 할당 단계(그림 3 및 그림 4)는 프로토콜의 중요한 측면이며 엄격한 게이트의 정의가 필요합니다. 피크 정의(그림 3)의 경우 신뢰할 수 있는 식별을 위해 최소 1,000개의 이벤트가 필요합니다. 이러한 의미에서, "벌크" 웰에 대한 세포 분류 단계 동안 더 많은 세포를 분리하는 것이 유익할 수 있습니다. 그림 4는 여러 패밀리를 포함하는 단일 웰의 네 가지 예를 설명합니다. 이 그림은 그림 2D 및 그림 3 게이팅의 중요성, 특히 각 패밀리와 각 피크의 식별에 대한 중요성을 명확히 합니다. 도 4A는 게이트 CF의 모든 셀이 서로 매우 가깝고 단일 피크에 쉽게 할당될 수 있기 때문에 간단한 예를 보여줍니다. 도 4C는 도 4D의 히스토그램에 명확하게 표시된 바와 같이, 2개의 잘 분리된 피크 상에 단음성으로 분포된 패밀리의 또 다른 예를 보여준다. 그림 4E,G는 많은 수의 이벤트를 기반으로 하는 엄격한 게이팅의 중요성을 보여줍니다. 둘 다 가까이 있지만 염료 조합 게이트 외부에 있는 이벤트를 거의 표시하지 않습니다. 이러한 이벤트는 단일 웰 분석만을 기반으로 VI 및 CF 게이트에 잘못 포함될 수 있습니다. 마지막으로, 그림 4F,H는 두 개의 유사한 강도 피크의 한 예(그림 4F)와 두 개의 동일하지 않은 강도 피크가 있는 하나의 예(그림 4H)와 함께 여러 피크에 퍼져 있는 패밀리의 두 가지 다른 예를 보여줍니다.

그림 3: 유세포 분석을 위한 피크 정의. (A-D) 피크는 모든 개별 피크에 대해 좋은 표현을 보장하기 위해 최소 500개의 이벤트를 등록하도록 정의되어야 합니다. (A) CFSE-A 강도에 대한 히스토그램. 여러 피크를 식별할 수 있으며, 각 피크는 분열하는 세포의 다른 집단에 해당합니다. (나,씨) 유도된 파라미터의 강도에 대한 히스토그램으로, CFSE-CTV 혼합물, CV(B) 및 VC(C)를 각각 나타낸다. (D) CTV-A 강도에 대한 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 피크 할당 . (A,B) CF 게이트에서 이 웰에 대해 하나의 피크만 감지할 수 있습니다. (씨, 디) 거의 동일한 강도의 두 피크가 VI 게이트의 이 우물에서 검출될 수 있습니다. 봉우리는 잘 해결되어 있습니다. (E,에프) 비슷한 강도의 두 피크가 VI 게이트의 이 우물에서 감지될 수 있습니다. 벌크 웰을 사용하여 설정된 전략에 따라 게이트의 이벤트만 고려되었습니다. (G-H) 이 우물, 게이트 CF에서 강도가 같지 않은 두 개의 피크를 검출할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

데이터 표현 및 통계 테스트
그림 5는 두 개의 개별 실험에 대한 서로 다른 유형의 데이터 표현을 보여주며, 둘 다 72시간의 세포 배양 후에 수행되었습니다. HSC와 MPP는 세포 분열 및 분화 특성을 변경하는 것으로 추정되는 두 가지 다른 세포 배양 배지에서 배양되었습니다. 이러한 매체의 이름은 "Diff"(미분)³² 및 "GT"³³; 첫 번째는 에리스로포이에틴(EPO)과 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 함유하고 있기 때문에 골수 및 적혈구 분화를 촉진하는 반면, 두 번째는 높은 비율의 HSPC를 유지하고 증폭하는 것을 목표로 유전자 치료 임상 시험의 맥락에서 개발되었습니다. 도 5A 는 다양한 세포군을 나타내는 조건 "Diff"에 대한 대표적인 히트맵이고, 세포의 운명과 분열 모두에서. 이 히트맵에서 각 행은 개별 패밀리를 나타내고, 각 사각형은 개별 셀을 나타내며, 열은 동일한 세대에 있는 모든 셀을 그룹화합니다(예: 2세대의 셀이 두 번 이상 분할됨). 단일 세포 유형으로 구성되고 동일한 수의 분열을 나타내는 매우 동질적인 가족(예: 패밀리 #63)과 두 세대에 걸쳐 세 가지 세포 유형을 포함하는 이종 패밀리(예: 패밀리 #84)를 구별할 수 있습니다. 이 분석에 대한 세포 회수율은 약 70%이기 때문에, 가능한 다른 세대(예를 들어, 1세대에서 한 세포의 패밀리와 2세대에서 2개의 셀로 구성된 패밀리)에서 모든 세포를 회수하는 것으로 정의되는 완전한 패밀리는 거의 관찰되지 않습니다( 그림 5A에서 ID 번호 옆에 해시태그 표시). 불완전한 검출을 설명하는 여러 가지 설명이 있으며, 이는 기술적(염색 문제, 프로토콜로 인한 세포 손실) 또는 생물학적(세포 사멸 및/또는 세포자멸사)일 수 있습니다. 기술적 한계는 개별 샘플과 관련된 데드 볼륨을 줄이도록 설계된 분석기를 사용하고 세포 배양 플레이트에서 직접 세포 염색을 수행하여 부피를 줄임으로써 피펫팅을 극복할 수 있습니다. 반대로, 세포 사멸의 양을 결정하는 직교 방법(예: 생세포 이미징 실험을 통해)은 불완전한 검출을 초래하는 기술적 및 생물학적 요인을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

도 5Bi 는 벌크 분석을 수행한 것처럼 세포 유형 조성물에 대한 배양 조건의 효과를 가시화하는 방법을 보여준다. 여기서 Diff 조건은 더 많은 수의 운명과 더 높은 비율의 CD34⁺ 세포(CD34^-를 제외한 모든 세포 유형으로 정의됨)를 촉진합니다. 신뢰 구간은 기본 부트스트랩을 통해 스크립트에서 계산되며, 250,000개의 부트스트랩된 데이터셋³⁴이 있다. 그림 5 의 다른 모든 히스토그램은 동일한 방식으로 계산된 신뢰 구간을 표시한다는 점에 유의해야 합니다. 표 5 는 각 세대의 패밀리 수 및 셀 수에 대한 모든 정보를 요약합니다.

도 5Bii 는 스크립트 "2_bar_plot"에서 수행된 통계적 테스트의 출력을 그래픽으로 나타낸다. 통계적 틀에 대한 공식적인 설명은 이용 가능하다²⁶. 간단히 말해서, 이 프레임워크는 관찰된 모든 세포 간의 독립성을 요구하는 고전적 통계와 달리 동일한 계열의 세포가 의존적이라고 가정하면서 통계적 가설 테스트를 가능하게 합니다(그 자체로 테스트 가능한 가정). 그림에 제시된 특정 사례에서 통계적 테스트는 배양에 존재하는 다양한 세포 유형의 빈도로 측정된 MPP의 세포 운명 선택이 사용된 세포 배양 조건과 무관하다는 가설에 도전합니다. 첫째, G-검정 통계량은 서로 다른 세포 매체의 세포 유형 빈도 간의 불일치를 평가하는 데 사용됩니다(예: Bii에서 이 통계는 빨간색 막대로 표시됨). 그런 다음 순열을 통해 데이터의 무작위화를 수행하여 두 세포 배양 조건 간에 전체 세포 제품군을 교환합니다. 이는 가족 관련 세포 간의 의존성을 유지하면서 각 집합의 가족 수를 원래 데이터와 일관되게 유지하기 위한 것입니다. G-검정 통계량은 랜덤 데이터 세트에서 계산됩니다. 5Bii 로 표시된 파란색 값은 250,000개의 순열에 대한 G-검정 통계량입니다. 마지막으로, p 값을 계산하여 원래 데이터 세트가 순열 데이터 세트의 분포에서 벗어나는 정도를 평가합니다. 이 예에서 원래 통계량은 분포에서 크게 벗어나 p 값이 작으므로 MPP의 세포 운명이 배양 조건과 무관하다는 가설을 기각합니다.

도 5C 는 최대 세대당 세포 패밀리의 백분율을 나타내며, 상이한 조건들이 세포 패밀리당 세포 분열을 어떻게 변화시키는지를 탐구한다. 이 데이터 플롯은 72시간에서 Diff 조건에서 배양된 세포가 GT 조건의 세포보다 더 많은 수의 분열을 완료한다는 것을 보여줍니다. 표현은 각 패밀리당 최대 세대 수이므로 1세대와 2세대의 셀을 표시하는 패밀리는 2세대로 간주됩니다. 도 5B 에 사용된 것과 동일한 통계적 프레임워크를 사용하여 세포 분열과 배양 조건 사이의 독립성을 통계적으로 테스트할 수 있다.

그림 5D 는 서로 다른 조상 유형(HSC 또는 MPP)에 대한 첫 번째 분할의 대칭/비대칭 유형을 탐색합니다. 두 딸 세포를 자매 세포로 확실하게 확립할 수 있는 유일한 세대인 1세대의 완전한 세포 패밀리의 경우, 4가지 다른 유형의 대칭/비대칭을 정의할 수 있습니다: "Sym Undiff"라는 레이블은 두 딸이 기원 세포의 표현형을 유지하는 패밀리를 설명합니다. "Sym Diff"는 두 딸이 동일한 표현형을 가지며 기원 세포와 다르다는 것을 의미합니다. "Asym Undiff"는 하나의 딸이 기원 세포의 표현형만을 유지한다는 것을 의미합니다. 마지막으로, "Asym Diff"는 두 딸이 서로 다른 표현형을 가지고 있고 그 중 어느 것도 기원 세포와 동일하지 않은 가족을 설명합니다. 이러한 대칭/비대칭 운명을 평가할 때 통계적 검정력을 얻으려면 1세대에서 자손이 발견된 더 많은 가족을 관찰하기 위해 초기 시점에서 MultiGen 분석을 수행하는 것이 바람직합니다.

마지막으로, 그림 5E 는 분열 수의 함수로서 세포 유형의 백분율을 나타내며, 분열에 걸친 분화 패턴 진행에 대한 통찰력을 얻습니다. 예를 들어, 도면에 표시된 데이터는 세포가 CD34^- 상태로 진행되며, 검출된 세포의 50% 이상이 단지 3개의 분열 후에 이 부류에서 진행된다는 것을 시사한다. 또한, MPP는 소수의 세포가 원래의 표현형을 유지하기 때문에 자가 재생 분열을 선호하지 않는다고 추론할 수 있습니다. 이러한 결론 중 일부는 이전 그림에 제시된 통계적 틀을 사용하여 테스트 할 수 있습니다.

그림 5: 제대혈 HSPC를 사용한 72시간 실험에 대한 데이터 표현의 예. (A) 선택한 데이터 세트에 대한 히트맵(HSC, "Diff" 배지, 배양 72시간 후). 플롯은 친족 관계(행), 수행된 분할 수(열, 생성이라고 함) 및 표현형(색상)에 따라 모든 개별 셀(사각형)을 나타냅니다. (비둘기) 조건 GT와 조건 Diff 사이에서 HSC 및 MPP의 세포 자손의 세포 유형 비율을 비교하는 히스토그램. (Bii) 그래프는 배양 72시간에서 MPP에 대해 "2_bar_plot" 스크립트에서 수행된 통계적 테스트를 나타내며, "Diff"와 "GT" 사이토카인 칵테일을 비교합니다. 실험 값은 빨간색으로 표시되고 250,000개의 순열을 통해 생성된 값은 파란색으로 표시됩니다. G-테스트의 p. 값은 테스트에 사용된 패밀리 수와 함께 오른쪽 상단 모서리에 표시됩니다 . (C) 배양 조건당 HSC 및 MPP에 대해 각 세대(색상으로 구분됨)의 가족(총 314개 가족)의 백분율을 비교하는 히스토그램. 신뢰 구간은 250,000개의 부트스트랩된 데이터 세트로 계산됩니다. (D) 1세대에서 두 개의 세포를 가진 가족에 대한 딸 세포의 운명 사이의 대칭/비대칭 유형을 나타내는 히스토그램: Sym Undiff(두 딸 모두 기원 세포의 표현형을 유지함), Sym Diff(두 딸 모두 동일한 표현형을 가지며 기원 세포와 다름), Asym Undiff(하나의 딸만이 기원 세포의 표현형을 유지함), 및 Asym Diff (두 딸은 서로 다른 표현형을 가지며 그 중 어느 것도 기원 세포와 유사하지 않음). (E) "Diff" 칵테일로 배양된 MPP에 대해 세대별로 분류된 세포 유형의 기여도에 대한 히스토그램; n = 204 세포 및 97 패밀리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 각 실험 조건(세포 기원 및 세포 배양 배지)당 분석된 패밀리 및 세포 수에 대한 설명. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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토론

MultiGen 분석은 림프구 23,24,35 및 쥐 조혈 세포 ^26,27을 연구하는 데 중요한 역할을 하는 고처리량, 수행하기 쉽고 비용이 많이 드는 분석법입니다. 여기에서 우리는 단기 배양을 사용하여 단일 세포 수준에서 인간 HSPC 투입의 초기 단계를 생체 외에서 해독할 수 있는 접근 방식의 새로운 개발을 제시합니다(그림 6). 단일세포 생체외 배양 시스템은 일반적으로 HSPC의 성숙한 세포로의 장기적인 운명을 평가하는 데 사용되지만, 일부 운명은 다른 운명보다 일찍 발생한다⁽³⁶), 잠재적으로 더 적은 운명으로 분석이 편향될 수 있다. 또한 이러한 문화 시스템은 일반적으로 운명 약속 중에 분열에 대한 정보를 놓치고 있습니다. 첫 번째 헌신 단계는 문화가 시작될 때부터 발생하는 것으로 나타났으며, 때로는 분열^26,37 없이 발생하는 것으로 나타났으며^, 이는 초기 운명 헌신을 연구하는 데 단기 문화와 추적 분열을 필수적으로 만듭니다. 운명, 분열 및 친족 관계를 동시에 추적함으로써 이 분석을 통해 인간 HSPC에서 첫 번째 분열과 운명 결정의 역할을 이해할 수 있습니다. 이 분석을 사용하면 헌신 과정이 얼마나 많은 분열이 발생하는지, 초기 선조에 대한 자기 재생과 차별화 사이의 균형, 그리고 이러한 속성이 세대에 걸쳐 어떻게 상속되는지 추론 할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 단일 세포 분해능에서 인간 HSPC에 대해 이러한 유형의 측정을 허용하는 유일한 분석법입니다. 또한 세포 분열 염료의 다양한 조합을 사용하여 분석 처리량을 증가시켜 이 분석을 대규모 데이터 세트를 빠르게 생성하는 데 유용한 도구로 만들었습니다. 염료 조합을 사용하면 동일한 웰에서 여러 패밀리를 추적할 수 있어 단기 배양에서 분석에 사용할 수 있는 세포의 수를 늘릴 수 있습니다. 다른 염료(예: 노란색 염료)를 추가하거나 CFSE와 CTV의 비율을 수정하여 조합의 수를 잠재적으로 훨씬 더 늘릴 수 있습니다. 그러나 이렇게 하면 분석할 수 있는 다른 매개변수의 수가 줄어듭니다.

그림 6: 프로토콜의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분석을 성공적으로 수행하려면 많은 수의 웰과 분석할 세포 수가 감소하기 때문에 플레이트 리더가 장착된 분석기에서 유세포 분석을 실행해야 합니다. 차세대 벤치 분석기는 특히 이 분석에 적합한데, 대부분의 분석기는 세포 손실 비율을 줄이기 위해 데드 부피가 더 작기 때문입니다. 이는 차례로 각 웰 전체를 회수할 때 더 높은 효율을 보장하며, 70% 범위(²⁶)에서 추정된 효율을 유도한다. 유세포 분석 획득 중 세포 손실을 추정하는 것은 각 개별 패밀리의 분석에 매우 중요합니다. 예를 들어, 세포 사멸이 없다고 가정하고 분열 횟수를 계수하면 각 패밀리당 세포 수를 추정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 일부 확증 실험, 특히 시험된 배양 조건에서 세포 사멸의 추정 및 정의된 수의 세포를 사용하여 실험적으로 회수율을 측정하는 것이 바람직하다.

이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 피크 할당입니다. 이미 언급했듯이, 양질의 피크 분포는 세포 분류에서 매우 좁은 피크의 분리에 크게 의존합니다. 그럼에도 불구하고 분포에 따라 고유한 수의 나눗셈을 할당하는 것은 여전히 어렵습니다. 세포 분류 및 유세포 분석은 서로 다른 두 대의 기계에서 수행되기 때문에 각 신호의 강도를 직접 비교할 수 없으므로 히스토그램의 오른쪽 끝에서 관찰된 첫 번째 피크가 피크 0인지 피크 1인지 알기 어려울 수 있습니다. 이와 관련하여 가능한 솔루션은 거의 없습니다. 한 가지 방법은 이들 세포에 의해 수행되는 분열의 수를 정확하게 측정하기 위해 직교 실험을 수행하는 것이다 (예를 들어, 살아있는 세포 이미징). 또 다른 가능성은 유세포 분석을 실행하기 전에 도립 명시야 현미경으로 웰의 세포 수를 간단히 계산하는 것입니다. 이것은 평균 분열 수를 추론할 것입니다(세포 사멸이 없다고 가정). 마지막으로, 피크 할당을 위한 사후 솔루션은 비정상적인 수의 "불가능한 패밀리"를 감지하는 것입니다. 이러한 패밀리는 세대당 가능한 수보다 많은 수의 세포로 구성됩니다(예: 2세대의 5개 세포 또는 1세대의 2개 세포 및 2세대의 1개 세포). 불가능한 패밀리를 제외할 수 있는 가능성은 통계 분석 단계에서 코딩되며 불가능한 패밀리에 플래그를 지정합니다. 이러한 오류의 발생률이 너무 높으면 피크 할당을 수정해야 한다고 가정하는 것이 합리적입니다.

이 프로토콜에서, 우리는 분석을 위한 데이터 표현 및 분석의 몇 가지 예를 포함시켰는데, 이는 이것이 대규모 데이터 세트의 생성 및 해석에 필수적인 단계가 되었기 때문이다³⁸. 첫 번째 예는 패밀리별로 구성된 분석된 모든 셀의 전체를 보여주는 히트맵입니다. 이것은 데이터의 일반적인 특성과 잠재적 결론을 탐색하는 효율적인 도구입니다 : 가족은 여러 세포 유형으로 구성되어 있습니까, 아니면 구성이 균질한 경향이 있습니까? 가족이 여러 세대에 걸쳐 분산되어 있습니까, 아니면 대부분 같은 횟수로 나누고 있습니까? 이 탐색적 분석은 보다 구체적인 플롯과 통계 테스트로 보완되어야 합니다. 대칭 및 비대칭 운명 헌신, 분열 없는 분화, 자기 갱신과 분화 사이의 균형, 주어진 약속 운명에 대한 분열의 수를 정량적으로 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 실험 계획 중에 질문 유형에 따라 세포 배양 길이를 설정하는 것이 기본입니다. 예를 들어, 처음 두 가지 질문(대칭/비대칭 균형 및 분할 없는 미분)의 경우 매우 짧은 배양 단계를 계획하면 분할을 하나만 수행하거나 전혀 수행하지 않은 많은 수의 가족을 격리할 수 있습니다²⁶. 반대로, 더 긴 실험을 통해 분화의 여러 단계에서 가족을 샘플링하기 때문에 특정 세포 투입에 필요한 분열 수를 탐색할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 세포 염료 희석이 7개 또는 8개 이상의 분열을 정확하게 추적할 수 없기 때문에 장기 배양(2-3주)을 위해 설계되지 않았다²². 결과적으로, 이 도구는 대부분 조혈 전구체의 초기 헌신을 연구하는 데 적합하며 이러한 세포의 장기 분화 특성에 대한 강력한 결론을 내리도록 설계되지 않았습니다.

통계적 틀은 이러한 유형의 데이터 분석을 위해 특별히 개발되었으며 순열²⁶의 개념을 기반으로 합니다. 이것은 세포 유형 분포와 수행 된 분열 수에 대한 가족 의존성을 관찰했기 때문에 필요했습니다. 즉, 동일한 패밀리에 속하는 세포도 유사한 표현형을 나타내고 동일한 횟수로 분열할 가능성이 더 큽니다. 심층 분석은 이 작업의 범위를 벗어나지만 다양한 조건을 평가할 때 제공된 통계 테스트 세트로 충분해야 합니다.

결론적으로, 이 프로토콜은 생체 외에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 세포 역학을 빠르고 저렴한 방식으로 평가하기 위한 귀중한 도구를 구성합니다. 시점, 배양 조건 및 분석된 HSPC 유형에 대한 유연성과 다양성으로 인해 다양한 실험 조건을 테스트할 수 있습니다. 유세포 분석 기반 분석법으로 대부분의 실험실에서 구현할 수 있으며 광범위한 사전 지식이 필요하지 않아 스크리닝 및 파일럿 실험에 적합합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes	vWR	87003-294
15-mL polypropylene tubes	vWR	734-0451
50-mL polypropylene tubes	vWR	734-0448
96-well U-bottom culture plate	Falcon	353077
Anti-human Lin APC	Thermo Fisher	22-7776-72	Dilution 1/40
ARIA III	BD		Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Life Technologies	C34570
Cell Trace Violet (CTV)	Life Technologies	C34571
Compensation beads	BD	552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Scientific	J62948-36	Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216	BD	564220	Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS)	Dutscher	S1900-500C	Batch S00CH
FlowJo v10.8.1	BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a	Biolegend	312216	Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3	BD	564195	Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581	Biolegend	343513	Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7	Biolegend	356620	Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100	BD	560673	Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100	BD	560675	Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10	Biolegend	328110	Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X	Life Technologies	10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes	Falcon
ZE5	Biorad		Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media			Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS			Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1%			Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer			Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X