이 연구에 의해 지원되었다 기금 - - 에이드 과학 진흥 (JSPS), 그랜트 - - 에이드에서 교육부, 일본 문화, 스포츠, 과학 기술의 보조금 인에 대한 일본 사회의 과학적 연구 일본의 과학 기술 기관, Neuroinformatics 일본 센터 (NIJC), RIKEN로부터 우선 분야 - 통합 뇌 연구 (Shien)에서 과학 연구 보조금에 의해 보조금의 새는 크레스트의 원조 -에 MEXT에서 일본. 우리는이 영화를 만드는 그들의 도움을 오하라 &amp; (주)와 마리코 하야시 감사드립니다.

프로토콜 <ol><li> 고가 플러스 미로 테스트에 사용되는 기기는 A +의 구성이며 중심 두 폐쇄 팔 (25 X 5 X 16cm)에 직각으로 서로 건너편이 열려있는 팔 (25 X 5 X 0.5 cm)로 구성되어 플랫폼 (5 X 5 X 0.5 cm). 폐쇄 무기가 팔을 묶으에 높은 (16 ㎝) 벽을 가지고 반면 오픈 팔, 폭포의 수를 감소하는 매우 작은 (0.5 cm) 벽 있습니다. 전체 장치는 바닥 위 50cm (오하라 &amp; (주), 도쿄)이며 빈 원형​​ 수조 (35cm 높이 100cm 직경; 정상적으로 모리스 물 미로의 작업에 사용)에 저장하거나 가을 쥐를 보호하기 위해 실험 도중 탈출을 시도한다. 장치는 플라스틱 재료로 만들어진 것입니다. 플랫폼은 흰색이고 벽면이 투명하고 있습니다. 소재와 고가 플러스 미로의 장치의 색상에 변화가 있습니다. </li><li> 마우스가 12 - H 조명 / 어두운주기 (오전 7시 불을)로 위치해 있으며, 같은 이전 (타카오 &amp; 미야 카와, 2006a) 설명했다. 행동 검사는 오전 9시 사이에 수행과 PM 6:00입니다. 모든 실험 생쥐는 행동 테스트 룸의 상태로 길들 가장 먼저 시험을 시작하기 전에 행동 테스트 룸 30 분으로 전송됩니다. 실험의 순서는 genotypes에 걸쳐 counterbalanced입니다. 연습 동물을 사용하여 테스트 재판의 두 목적이 있습니다. 하나는 모든 기록 시스템을 잘되어 있는지 확인하는 것입니다. 또 가능한 한 균일 같은 테스트 조건을 유지하는 것입니다. 즉, 전체 세션의 최초의 마우스는 연습 재판 절차도없이 다른 사람 (즉, 시험 운영 및 이전 실험로부터 악취 신호에 의해 사전없이 소음)와 다소 다른 조건을 경험합니다. 동물 교토 대학의 동물 연구위원회의 지침에 따라 유지 관리됩니다. </li><li> 동작 테스트 룸 (170 X 210 X 200cm, 오오하라 &amp; (주), 도쿄) 방음이며 조명 수준은 100 럭스에서 관리하고 있습니다. 마우스가 폐쇄 팔쪽으로 감독의 머리와 미로의 중심 영역에 배치됩니다. 고가 플러스 미로 시험은 원격 장치에 의해 제어하는​​ 컴퓨터에 부착된 비디오 카메라를 사용하여 기록됩니다. 각 팔과 오픈 무기 시절에 항목 번호 (항목을 마우스의 질량은 팔을 입력의 중심으로 정의)을 기록하고 이러한 측정 불안과 같은 행동의 색인 역할을하고 있습니다. </li><li> 생쥐 10 분 미로에 대해 자유롭게 이동할 수 있습니다. 각 마우스의 배터리 테스트에서 한 재판을 받게됩니다. 행동 데이터 (이미지 EP)를 취득하고 분석에 사용되는 응용 프로그램은 공개 도메인 이미지 J 프로그램 (정신 건강의 국립 연구소에서 웨인 Rasband 개발과에서 구할 수를 기반으로 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ 엘제이 /</a> 츠요시 미야 카와 (오하라 &amp; (주), 일본 도쿄를 통해 제공되는)로 바뀌었습니다). </li><li> 거리는, 여행을 양팔로 항목의 숫자, 시간은 각 팔에 소비하고, 오픈 무기로 항목의 %가 이미지 EP 프로그램에 의해 계산됩니다. </li><li> 각각의 시험 후, 모든 무기와 중심 지역은 효율적인 악취 제거 에이전트이며 후각 단서에 따라 편견을 방지하기 위해 다른 청소 솔루션에 비해 자체의 비교적 약한 냄새를 가지고 슈퍼 hypochlorous 물로 세척합니다. 따라서 우리는 후각 신호에 대한 제어 상태에서 테스트를 수행할 수 있습니다. </li></ol>

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C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+mouse+behavior:+interactions+with+laboratory+environment.">Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment.</a> Scienc. 284, 1670-1672 (1999).</li></ol>

모든 절차가 교토 대학의 동물 사용 및 관리위원회에 의해 승인되었습니다.

마우스 게놈이 합성되어 있지만, 유전자의 대부분의 기능은 알려져 있지 않습니다. 유전자 조작 기술은 마우스의 특정 유전자 (..; 아이바 외, 2007 오스틴 외, 2004)의 삭제 또는 다른 조작을위한 수 있습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 다음 돌연변이 생쥐 (.; 타카오 외, 2007 타카오와 미야 카와, 2006b)의 행동 분석을 실시하여 결정하실 수 있습니다. (; 크롤리 2007 년 로저스와 Dalvi, 1997) 고가 플러스 미로 시험 불안의 모든 현재 동물 모델의 가장 인기있는 시험 중 하나입니다. 행동 같은 불안에 대한이 테스트는 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 (크롤리, 1999) 심사 및 phenotyping과 약물 발견에 사용되고 있습니다 (. 호그 외 1996; 크롤리, 2007). 고가 플러스 미로 테스트 anxiolytic 약물 (; Mechiel 코르테와 데 보어, 2003, 크롤리, 2007 로저스와 Dalvi, 1997), 검사에 대한 강력한 예측 타당성을 가지고 항목의 번호로를 anxiolytic 마약 특별히 증가하고, anxiogenic 약물은 특별히 감소 쌍수와 시간이 보냈다. 전체 항목의 점수와 총 거리는 일반적인 활동의 유용한 인덱스로 간주됩니다. 총 항목 점수도 불안의 인덱스이며, 각 팔에 소비 항목과 시간의 비율은 기본 불안의 색인 (로저스와 Dalvi, 1997, Mechiel 코르테 및 데 보어, 2003) 구성합니다. 열고 닫힌 팔을은 같은 탐험 드라이브를 보여주고 것으로 간주되며, 따라서 오픈 무기의 소지를 없애기는 공포의 높은 수준의 (로저스와 Dalvi, 1997)의 유도의 결과로 간주됩니다. 그것은 개방적이고 높은 공간에 대한 공포로 인해 발생합니다 생쥐의 혐오감은 미로의 쌍수를 탐험하는 생각입니다. 1984 년, 핸들리 및 Mithani은 고가 X (플러스) 미로 테스트 위에서 설명한와 사전 작업에보고했다. 원래 시험 장치는 바닥 위 70cm를 제기하고, 10cm 폭으로 길이 45cm를 측정 각각의 폐쇄 둘 더하기 둘은 오픈 암스을 구성했다. 그들의 초기 연구에서, 그들은 총 / 오픈 팔 항목의 비율 (핸들리 및 Mithani, 1984)를 발표했다. 와 생쥐 (리스터, 1987) 이후, 다른 인덱스는 쥐 (펠로우 및 파일 1986 펠로우 외, 1985)에 대한 폐쇄와 개방 팔을 시절 폐쇄와 개방 무기와 시간에 항목의 수를 포함되는 개발되었습니다 . 고가 플러스 미로 시험 변경은 오픈 암스 (50 X 10cm)과 높이 주변 벽과 닫힌 팔에 열린 지붕 닫힌 무기 (50 X 10 X 40cm) 모두 길어, 그리고 전체 미로가 올라가 있었을 포함 50cm (; 펠로우 및 파일 1986 펠로우 외, 1985)의 높이. 현재, 저희 연구실에서 고가 플러스 미로 시험 장치는 두 직각으로 서로 건너편이 오픈 암스 (아주 약간의 25 X 5cm, 0.5 - cm, 벽)와 A +의 형태로 구성됩니다 마나베 외, 2000;, 미야 카와 외, 2001; 시거 외, 2004; Morishima 외, 2005; 폐쇄 무기 (25 X 5 X 16cm), 그리고이 바닥 위 50cm (미야 카와 외, 1996 증가합니다 미야모토 외, 2005; 화살표 외, 2006; 핫토리 외, 2007; 니만 외, 2007; 사노 외, 2008; Horii 외, 2008; 후쿠다 외, 2008; 이케다 외, 2008). 마우스 + (5cm X 5cm)의 중심부에 위치하고 자유롭게 미로를 탐험 수 있습니다. 5 분 녹음이 일반적인지만, 문제는 표현형를 검색할 수있는 기회를 증가하기 위해 프로토콜에서 10 분 기록됩니다. 열고 닫힌 높은 무기는 탐구 충돌 (; 크롤리, 2007 Mechiel 코르테와 데 보어, 2003)을 유발. 고가 플러스 미로 시험의 대책은 실험 기간 동안 관찰자에 의해 기록됩니다. 저희 연구실에서는, 시험은 컴퓨터와 행동 데이터 (이미지 EP) 인수와 이미지 EP 프로그램을 사용하여 분석 아르에 연결된 비디오 카메라로 기록됩니다. 폐쇄 무기 대 오픈 팔에 지출 총 팔 항목의 수를 비교 팔, 시간 개방에 항목의 번호, 불안 같은 행동의 조치를 제공합니다. 우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 유전자 조작 돌연변이 생쥐보다 90 변종을 평가하고 5000 개가 넘는 생쥐 (야생 - 타입과 돌연변이 생쥐 포함)에 대한 원시 데이터의 큰 세트를했습니다. 우리의 테스트 배터리에 야생 형 littermates은 일반적으로 컨트롤로 사용됩니다. 배경 스트레인으로 C57BL/6J 마우스가 널리 사용됩니다. 우리는 행동 테스트에서 C57BL/6J 마우스의 데이터를 수집. 우리의 고가 플러스 미로 테스트에서 C57BL/6J 마우스에서 얻은 값은 다음과 같습니다 (N = 914; SEM을 의미), 총 거리는 여행 : 1547.55 14.27 cm; 보낸 시간 기간 : 56.49 2.42 S (쌍수), 384.02 3.13 S (폐쇄 팔), 161.90 2.17 S (미로 센터), 시간의 비율은 쌍수의 지출 : 9.19 0.36 %, 닫힌 팔에 보낸 시간 비율 : 63.82 0.52 %; 항목의 개수 : 7.64 0.21을 (쌍수) 24.32 0.28 (폐쇄 무기); % 오픈 팔 항목 : 78.1 0.05 : 21.9 0.05는 %가 무기 항목을 마감했다. C57BL/6J 마우스가 닫힌 무기 (P &lt;0.0001, N = 914, 이점 - T T보다 쌍수에 적은 시간을 보내고동부 표준시). 이것은 C57BL/6J 마우스가 쌍수를 방지하는 경향을 나타냅니다, 그리고 시간이 쌍수에 보냈다는 불안과 같은 행동의 유효한 인덱스입니다. 시험 번호가 쌍수 및 중앙 플랫폼에서 보낸 시간에 영향을하기 때문에 또한, 재판의 순서는 genotypes에 걸쳐 counterbalanced입니다. 즉, 지수 1 생쥐 (P = 0.0089, N = 476) (게시되지 않은 데이터)에 비해 3, 4 생쥐 동안 모두 증가합니다. 우리 프로토콜 이상 1,661 생쥐의 분석은 새장에 테스트 생쥐의 순서가 크게 열린 팔 숙박 시간 (게시되지 않은 데이터)에 영향을주지 않는다는 것을 보여주었다. 즉, 새장에서 가져온 첫 번째 생쥐의 공연은 크게, 두 번째의 그 세 번째 또는 마지막 쥐를 다를하지 않습니다. Tujimura 외, 2008,, 나카 지마 외, 언론에서 고가 플러스 미로 테스트와 어둠 / 빛으로 전환 테스트 모두 행동과 같은 불안을 평가에 사용되고 있지만, 결과는 그들 (사이에 항상 홈즈 외, 2000, 일관되지 않습니다 ) 예를 들어, forebrain 특정 calcineurin - 녹아웃 마우스는 어둠 / 빛으로 전환 시험에서 조명 챔버의 시간이 감소 금액을 지출하지만, 고가 플러스 미로 시험 (미야 카와 외에 쌍수 시간의 증가 금액입니다. , 2003). 우리의 행동 테스트 전지의 요소 분석은 고가 플러스 미로 테스트와 어둠 / 빛으로 전환 테스트 같은 어둠 / 빛으로 전환 시험에 밝은 공간 불안과 개방 공간 불안처럼 같은 불안과 같은 행동의 다양한 측면을 평가했음을 나타냅니다 오픈 필드 테스트 (; 야마사키 외, 2006 타카오와 미야 카와, 2006b)에서 동작. 따라서, 어둠 / 빛으로 전환 테스트와 고가 플러스 미로 테스트를 모두 우리의 행동 테스트 배터리에 포함되어 있습니다. 크래브와 동료들은 돌연변이를 특성화 통제 변수와 실험 특정 실험실 (크래브 외., 1999)와 관련된 결과를 얻을 수 있습니다 보도했다. 실험실 사이에 존재하는 절차적 차이점은 어려운 복제하거나간에 결과를 비교합니다. 프로토콜의 시각 설명서를 구축하면 이러한 검사를 사용하는 실험실에 걸쳐 돌연변이 생쥐 및 다양한 변종의 행동 phenotypes의 비교에 사용되는 프로토콜의 표준화를위한 수 있도록 실험 절차의 이해를 증진 부과됩니다. 우리는 이전에 어둠 / 빛으로 전환 시험 (타카오와 미야 카와, 2006a)의 영화 프로토콜을 발표했다. 마찬가지로, 같은 오픈 필드 테스트와 같은 다른 프로토콜의 영화, porsolt 수영 테스트를 강제하고, 우리의 행동 테스트 배터리에 사용할 공포 컨디셔닝 테스트는 현재 미래의 비디오 저널 기사로 게시를 위해 만들어지고 있습니다.

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<td>Elevated plus maze</td>
<td>Tool</td>
<td>O&#x2019;hara & Co.</td>
<td>(none)</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
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		</div>

elevated plus maze for mice

마우스 게놈이 완전히 합성이지만, 두뇌에 표현 유전자의 대부분의 기능은 알려져 있지 않습니다. 특정 행동에 특정 유전자의 영향은 돌연변이 생쥐의 행동 분석에 의해 결정하실 수 있습니다. 대상 유전자가 두뇌로 표현하면, 돌연변이 생쥐의 행동 표현형는 정상적인 행동의 유전 메커니즘을 명료하게하다 수 있습니다. 고가 플러스 미로 테스트 동작 같은 불안을 측정하는 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 시험은 자연 열고 높은 영역에 대한 마우스의 혐오감뿐만 아니라 소설 환경에서 자연 자연 탐험 행동을 기반으로합니다. 장치는 무기와 폐쇄 팔, 서로 수직으로 중간에 건너, 그리고 중심 지역 개방으로 구성되어 있습니다. 생쥐는 무기의 모든에 대한 액세스 권한을 부여하고 그들 사이에 자유롭게 이동할 수 있습니다. 무기 열고 오픈 무기 시절에 항목의 숫자는 마우스의 오픈 스페이스 유발 불안의 인덱스로 사용됩니다. 불행히도, 연구소 사이에 존재하는 절차적 차이점은 어려운 중복 실험실 간의 결과를 비교합니다. 여기, 우리는 고가 플러스 미로 테스트를위한 프로토콜을 보여주는 상세한 동영상을 제시한다. 저희 연구실에서는, 우리는 영화에 표시된 프로토콜을 사용하여 돌연변이 생쥐보다 90 변종을 평가했습니다. 이러한 데이터는 지금 우리가 건설하는 공공 데이터베이스의 일부로 공개되지 않습니다. 프로토콜의 시각화 돌연변이 생쥐의 다양한 변종의 행동 phenotypes의 다른 연구소와 비교에 사용되는 프로토콜의 표준화에 대한 허용, 전체 실험 절차의 세부 사항 이해를 증진이 테스트를 사용하여 평가됩니다.

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Elevated Plus Maze for Mice

고가 플러스 미로 테스트에서 마우스 동작과 같은 불안을 측정하는 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리는 테스트를 수행을위한 세부 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 고가 플러스 메이즈

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Research

JoVE Journal

Biology

89.7K 조회수.  Graduate School of Medicine, Kyoto University. 고가 플러스 미로 테스트에서 마우스 동작과 같은 불안을 측정하는 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리는 테스트를 수행을위한 세부 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

비디오: Elevated Plus Maze for Mice

Light/dark Transition Test for Mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

The light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie that shows detailed procedures on how we conduct the test.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

연구

생물학

Morris Water Maze Experiment

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered non-fat milk or non-toxic tempera paint, where they must swim to a hidden escape platform. Because they are in opaque water, the animals cannot see the platform, and cannot rely on scent to find the escape route. Instead, they must rely on external/extra-maze cues. As the animals become more familiar with the task, they are able to find the platform more quickly. Developed by Richard G. Morris in 1984, this paradigm has become one of the "gold standards" of behavioral neuroscience.

The Morris water maze is a well-accepted tool used to document the involvement of the hippocampus in a behavioral task.

모리스 워터 메이즈 실험

The Morris water maze is widely used to study spatial memory and learning. Animals are placed in a pool of water that is colored opaque with powdered ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

중합 효소 사슬 반응 : 기본 프로토콜 플러스 문제 해결 및 최적화 전략

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

Milk Collection Methods for Mice and Reeves' Muntjac Deer

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native host. Milk collection from animals allows scientists the opportunity to study many aspects of reproduction including vertical transmission, passive immunity, mammary gland biology, and lactation. Obtaining adequate volumes of milk for these studies is a challenging task, especially from small animal models. Here we illustrate an inexpensive and facile method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer that does not require specialized equipment or extensive training. This particular method requires two researchers: one to express the milk and to stabilize the animal, and one to collect the milk in an appropriate container from either a Muntjac or mouse model. The mouse model also requires the use of a P-200 pipetman and corresponding pipette tips. While this method is low cost and relatively easy to perform, researchers should be advised that anesthetizing the animal is required for optimal milk collection.

Milk Collection Methods for Mice and Reeves&#039; Muntjac Deer

Milk collection from animal models facilitates various research avenues: understanding passive immunity, identifying pathogens responsible for vertical transmission and, through the use of transgenic mice, even commercial production of proteins found in human breast milk. Here we illustrate a simple method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer.

마우스 및 꿰 문착 사슴 우유 수집 방법

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.

신생아 마우스의 정맥 주사

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are ...

Subcloning Plus Insertion (SPI) - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a &#8216;targeting&#8217; vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.

Subcloning Plus Insertion SPI - A Novel Recombineering Method for the Rapid Construction of Gene Targeting Vectors

Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term &#8216;subcloning plus insertion&#8217;, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.

서브 클로닝 플러스 삽입 (SPI) - 유전자 타겟팅 벡터의 신속한 건설 소설 Recombineering 방법

Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic ...

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The establishment of an auxin gradient is a key event leading to phototropism and gravitropism. Previously, polar auxin transport (PAT) was shown to establish an auxin gradient in different cellular domains of plants. However, Han et al. recently demonstrated that for proper auxin gradient formation, plasmodesmal callose-mediated symplasmic connectivity between the adjacent cells is also a critical factor. In this manuscript, the strategy to elucidate the role of particular genes, which can affect phototropism and gravitropism by altering the symplasmic connectivity through modulating plasmodesmal callose synthesis, is discussed. The first step is to screen aberrant tropic responses from 3-day-old etiolated seedlings of mutants or over-expression lines of a gene along with the wild type. This preliminary screening can lead to the identification of a range of genes functioning in PAT or controlling symplasmic connectivity. The second screening involves the sorting of candidates that show altered tropic responses by affecting symplasmic connectivity. To address such candidates, the movement of a symplasmic tracer and the deposition of plasmodesmal callose were examined. This strategy would be useful to explore new candidate genes that can regulate symplasmic connectivity directly or indirectly during tropic responses and other developmental processes.

This article describes the methods for screening the genes controlling plasmodesmal permeability and hence auxin gradient during tropic response. This includes the measurement of the degree of tropic response in hypocotyl of Arabidopsis thaliana and checking plasmodesmal permeability by 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) loading and finally callose level assessment.

전략은 트로픽 응답에 Callose 매개 Plasmodesmal 게이팅의 역할을 확인하려면

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

마우스에서 심근세포 절연을 위한 영양 관류 방법

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Terminal H-reflex Measurements in Mice

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits after injuries such as spinal cord damage or stroke. An increase of the H-reflex response, together with symptoms like non-voluntary muscle contractions, pathologically augmented stretch reflex, and hypertonia in the corresponding muscle, is an indicator of post-stroke spasticity (PSS).
In contrast to rather nerve-unspecific transcutaneous measurements, here, we present a protocol to quantify the H-reflex directly at the ulnar and median nerves of the forepaw, which is applicable, with minor modifications, to the tibial and sciatic nerve of the hindpaw. Based on the direct stimulation and the adaptation to different nerves, the method represents a reliable and versatile tool to validate electrophysiological changes in spasticity-related disease models.

The clinical evaluation of spasticity based on the Hoffmann reflex (H-reflex) and using electrical stimulation of peripheral nerves is an established method. Here, we provide a protocol for a terminal and direct nerve stimulation for H-reflex quantification in the mouse forepaw.

마우스의 말단 H-반사 측정

The Hoffmann reflex (H-reflex), as an electrical analog to the stretch reflex, allows electrophysiological validation of the integrity of neural circuits ...

A Modified Technique for Transverse Aortic Constriction in Mice

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of pressure overload in mouse models. The main challenge of this procedure is to clearly visualize the transverse aortic arch and precisely band the target vessel. Classical approaches perform a partial thoracotomy to expose the transverse aortic arch. However, it is an open-chest model that causes a rather large surgical trauma and requires a ventilator during the surgery. To prevent unnecessary trauma and simplify the operating procedure, the aortic arch is approached via the proximal proportion of the sternum, reaching and binding the target vessel using a small self-made retractor that contains a snare. This procedure can be conducted without entering the pleura cavity and does not need a ventilator or microsurgical operation, which leaves the mice with physiological breathing patterns, simplifies the procedure, and significantly reduces operation time. Due to the less invasive approach and less operation time, mice can undergo fewer stress reactions and recover rapidly.

The present protocol describes a modified and simplified technique with a minimally invasive transverse aortic constriction (TAC) procedure using a self-made retractor. This procedure can be conducted without a ventilator or microscope and introduces pressure overload, eventually leading to cardiac hypertrophy or heart failure.

생쥐의 횡방향 대동맥 수축에 대한 수정된 기술

Transverse aortic constriction (TAC) is a frequently used surgery in research regarding heart failure and cardiac hypertrophy based on the formation of ...