연구는 보건 보조금 국립 연구소 AI - 52381, CA138623 및 켄터키 폐암 연구위원회와 제임스 그레이엄 브라운 암 센터에서 제도적 지원에 의해 지원됩니다.

방법론 현미경에 대한 설명 라이브 셀 이미징 실험 이클립스 TE300 니콘 인버티드 현미경에 부착된 TE - FM 에피 형광 시스템을 사용하여 수행된. 현미경 난방 무대를 갖춘. 멋진 스냅 HQ 디지털 B / W CCD (로퍼 과학) 카메라와 LAMDA 10-2 광학 필터 체인저 (서터 악기 회사) 현미경에 첨부되어 있습니다. 여기 및 발광 파장은 필터 바퀴 제어 및 Lamba 10-2 필터 휠 컨트롤러에 의해 제어되며, 셔터 인 스트 루먼트 (주) 노출 시간이 500 MS 충분히 살 세포에 RFP 또는 GFP를 볼 수 있어야합니다. 하드웨어 제어와 이미지의 취득 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어됩니다. EGFP / DsRed 듀얼 이색성, 채도 기술, 현재 연구에 대한 필터의 선택은, 필터 S480/20x, S525/40m 및 S565/25x, GFP 및 RFP에 대한 S620/60m, 각각을 설정하고 있습니다. 이 필터 휠은 여섯 필터 세트 수용할 수 있습니다. 현미경는 조이 스틱과 함께 이전 Proscan 무대 컨트롤러와 연결되어 있습니다. 이러한 모든 하드웨어 첨부 파일 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어하실 수 있습니다. 현미경도 micropipettes를 잡아 Micromanipulators와 함께 첨부되어 있습니다. A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션 위에서 설명한 현미경 설정을 사용하여, 우리는 실시간으로 리간드 감독 돌기 세포 이주를 다음의 방법을 개발했습니다. 두 micromanipulators (Narishige)은 현미경에 연결된 있습니다. LTB 4 기울기 방향으로 돌기 세포 (BMDCs) 파생 마우스 골수의 chemotaxis이 기록되었다. 여기서 우리는 마이크로 피펫에 리간드를로드하고 세포의 방향성 마이 그 레이션을 모니터링하기 위해 현미경의 온수 무대에 chemotaxis 실험을 설정, 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 pipettes를 준비하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 마이 그 레이션뿐만 아니라 라이브 세포의 chemotaxis의 억제제의 효과를 유도에서 독특한 chemoattractants의 효능을 테스트하기 위해 적용할 수 있습니다. 마우스 BMDCs 21 고립은 조브 22 등 여러 출판물에 설명되어 있습니다. 1. BMDCs의 준비 <ol><li> 커버 슬립 아래 플루오로 요리하고, 그들이 앞서 실험의 16 시간을위한 성장 수에있는 플레이트는 BMDCs (10 일간 culturing 후). </li><li> 1X PBS 3 ML 적어도 2 회 (접시에 1X PBS 3 ML를 추가하고 버퍼 출력을 aspirating하여)와 세포를 씻으십시오. </li><li> 접시에 1XPBS 2 ML을 추가합니다. 세포는 이제 실험을 위해 준비가되어 있습니다. ° C 인큐베이터 사전 실험 37 세포 보관하십시오. </li></ol> 리간드 로드된 마이크로 피펫의 준비 : <ol start="4"><li> 수직 micropipette 풀러 (Narishige 국제 미국, 부동산)에, 유리 모세관 튜브 (6 &quot;고양이 # 625500, AM 시스템, INC 유리 표준, 0.75 mm X 0.4 mm) 이후의 수정 프로그램입니다. </li><li> 52 살에 온도를 유지 ° C와 유리가 날카로운 모서리 도움말을 형성 녹으 분열 시키려고 수 있습니다. </li><li> 마이크로 피펫 홀더에 피펫을 수정. </li><li> M - 900 (Narishige 국제 미국, Inc의) 현미경으로 관찰하여 마이크로 포지를 사용하여 마이크로 피펫의 거친 가장자리를 부드럽게. </li><li> 각 실험에 대한 최소한 10-20 pipettes 준비. 참고 : micropipettes도 세계 정밀 계측기 (μ 팁, T1801TW1F)에서 구입하실 수 있습니다. </li><li> 1 ML effendorf 튜브에 리간드의 원하는 농도 (현재 실험에서 100 nm의 LTB 4 500 μL)을 가지고 솔루션에 마이크로 피펫 팁을 유지하고 솔루션은 마이크로 피펫 (다시 작성)로 입력할 수 있습니다. </li><li> 리간드와 주사기 (1 CC 투베르쿨린 주사기)에 1 ML을 가지고 천천히 처음부터 마이크로 피펫으로 마이크로 작성 바늘 (28G MF - 5, 세계 정밀 계측기)를 사용하여 리간드를 입력합니다. </li><li> 리간드으로 가득 한 ML의 주사기에 연결된 (21 G 2분의 11) 바늘로 피펫 및 튜브에 피펫으로 단단히 맞는 튜브를 연결합니다. </li><li> 이제 조심스럽게 마이크로 manipulators에 현미경 스테이지 및 수정하는 마이크로 피펫을 가득 리간드를 이동합니다. </li><li> 확인 리간드 천천히 끝에서 공개하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 현미경을 도금 미숙 BMDCs을 지참하고 온수 플레이트 (37 ° C) 무대에서 그들을 유지. </li><li> 플루오로 요리의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> 기름 침지 60X 목적 렌즈를 사용하여 세포를 집중. </li><li> 신중하게, 세포의 근접에 &#39;거친 수동 조작하는 사람 MN - 188NE&#39;를 사용하여 피펫을로드 리간드를 가지고. </li><li> &#39;유압 파인 Micromanipulator MN - 188 NE&#39;를 사용하여 피펫을 집중. </li><li> 리간드가 그릇에 공개되어 있는지 확인하기 위해 주사기에서 약간의 압력을 적용합니다. </li><li> 의 취득 이미지 수집 매개 변수를 설정 밝고 Metamorph 소프트웨어를 사용하여 2 시간을 위해 매 15 초에 (1​​0 MS 노출) 제기했다. </li><li> PR에 대한 매 30 분 모니터링 유지리간드 대한 마이 그 레이션 ogression. </li><li> 세포 피펫 끝에 혼잡한 경우, 실험의 마이 그 레이션을 계속 접시에 끝의 위치를​​ 변경합니다. </li></ol> B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation 1. 플라스미드 DNA 구조의 준비 DNA 플라스미드 구조의 세부 사항은 Jala 외. (2005) 18에 설명되어 있었다. 2. RBL - 2H3 세포로 인간 BLT1 - RFP 및 β - Arrestin - GFP의 Transfection <ol><li> 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 37 셀 (60-70% 합류) · 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2를 유지 성장 미디어 monolayer 문화 (DMEM가 15% FBS, 2 보충으로 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린과 T75 flasks 100 μg / ML의 스트렙토 마이신). </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML (0.05 %의 트립신, 0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))을 사용하여 37에서 5 분 잠복기에 의해 접시 / flasks에서 세포를 분리 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 5 % CO 2. 부드럽게 세포의 분리의 정도를 모니터링하는 flasks를 흔들. </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 6 ML을 포함하는 플라스크로 성장 미디어 6 ML을 추가하고 여러 번 아래 pipetting과로 그들을 혼합하여 세포를 수집합니다. 15 ML 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 세포를 카운트하고 transfection 미디어 200 μL 3 분 및 resuspend에 대한 480g RPM (DMEM, 20 % FBS, 50 MM HEPES) 15 ML의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 X 10 6 세포를 가져가라. 당신이 3 transfections을 수행하려는 경우, 증가하는 휴대폰 번호와 transfection 매체의 볼륨에 의해 따라 셀 및 tranfection 미디어를 준비합니다. </li><li> 최소 1.5 μg / μL의 농도에 transfected 수 plasmids를 준비합니다. 우리는 QIAGEN의 맥시 DNA 플라스미드 키트에게 사용하여 플라스미드 DNA를 준비합니다. 0.4 cm 전극 간격을 살균 전기의 cuvettes (바이오 - 래드 # 16552088)에 대한 개인이나 인간 BLT1 - RFP (25 μg)과 β - arrestin1 - GFP (15 μg)을 모두 플라스미드 DNAs 인코딩을 추가합니다. </li><li> 위의 resuspended 세포 200 μL를 가지고 hBLT1 - RFP 또는 β - arrestin1 - GFP 또는 둘 모두가 함께 중 하나를 포함 cuvettes에 배치하고 1 ML 멸균 피펫 조심스럽게 그들을 섞는다. </li><li> 10 분 상온에서 위의 cuvettes를 남겨주세요. </li><li> 전압 250 V 및 용량 500 μF와 진 Pulser II의 세포를 Electroporate. </li><li> electroporation 후 세포를 10 분 실온에서 머물게. </li><li> 정기적인 성장 매체 1 ML를 타고 cuvettes에 electroporated 세포와 함께 섞는다. </li><li> , 5 % CO를 정기적으로 성장 미디어 2 ML을 포함 35mm 조직 유리 바닥 문화 요리 (플루오 요리, 세계 정밀 계측기)에이 혼합 300 μL를 배포하고 37 1 시간에 대한 품어 ° C를 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 2. 세포는 접시의 바닥을 준수하도록 허용합니다. </li><li> 정기적인 성장 매체와 부화 1 H 후에 미디어를 교체하고, 37에서 성장 허용 ° 95 %의 공기의 humidified 분위기에서 C, 18-24 시간 5 % CO 2 배양기를. </li></ol> 3. 라이브 셀 이미징 이미지의 취득 <ol><li> 18-24시 이후, 10 MM의 HEPES, 산도 7.55을 (플레이트 및 대기음 미디어에 직접 따뜻한 미디어 2 ML을 추가합니다. 반복 2 또는 3 회)가 들어있는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI 2 ML있는 셀에 2 또는 3 번 씻는다. 10 MM의 HEPES를 포함하는 따뜻한 페놀 레드 무료 RPMI의 1.8 ML를 추가합니다. </li><li> hBLT1 - RFP 및 온수 현미경 무대에서 β - arrestin1 - GFP (37 ° C)와 transfected RBL - 2H3 세포를 포함한 플레이스 30mm 유리 coverslip 바닥 문화 요리. </li><li> 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈 (우리의 현미경 시스템에서 사용할 수있는)를 사용하여 600x 배율에서 셀 이미지를 수집합니다. </li><li> 60 X의 객관 렌즈 하나 기름 방울을 넣고 일반 명시야와 세포 초점을 맞추고 접시의 바닥을 만져 빛을 전송. </li><li> transfected 단백질의 형광, 형광 필터 (RFP 필터, 당신이 β - arrestin1을보고 싶으면, 수용체 또는 GFP를보고 싶은 경우) 명시야 (전송 빛)에서 스위치를 모니터링합니다. </li><li> RFP 필터 및 이미지를 캡처를 사용하여 세포 표면에 hBLT1 - RFP을 표현하는 밝고 건강한 세포를 선택합니다. </li><li> 그런 GFP 필터 전환 및 β - arrestin - GFP의 세포질로 표현되었는지 확인하고 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 의사 컬러 모두 이미지 캡처 시간이 형광을 통해 출혈이 RFP와 GFP 사이에 발생을 복용하지 않도록 라이브 셀 이미지를 타락한 전에. </li><li> 휴대폰의 선택이 만들어되면, 소프트웨어를 사용하여 목적 (이 인스턴스에서 Metamorph 소프트웨어)에 따라 매개 변수를 설정합니다. </li><li> 현재 시연에서는, 16 비트 이미지는 온과 함께 찾았습니다라스의 비닝의 1로 설정 60 X 객관적 니콘 계획 APO 60X/1.4 수치 조리개 기름 침지 렌즈와 결합된 X 1. </li><li> Metamorph 소프트웨어에 의해 제어되는이 사용하는 필터 바퀴 30 초 시간 간격 (translocation / 상호 작용을 너무 빨리하는 경우, 그 중 하나가 시간 간격을 줄일 수)에 동시에 RFP 및 GFP의 fluorochromes에 대한 형광 이미지를 수집합니다. </li><li> 카메라 노출 시간은 RFP 및 GFP 1000 밀리초로 설정하십시오. (RFP 및 GFP의 형광 강도에 따라 특정 노출 시간을 설정합니다.) </li><li> 첫 공 시점 역할을 추가 리간드없이 1 분에 대한 이미지를 수집합니다. </li><li> 1 분 후 접시 / 또는 셀 위치를 방해하지 않고 리간드의 200 μL를 (10 μm의 재고에서 1 μm의의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 형광 이미지는 파일 이름의 증가 순서로 리간드를 삽입한 후 60 분에 대한 수집 및 TIFF 이미지로 저장됩니다. </li><li> 이러한 모든 파일은 소프트웨어를 사용하여 타임 스탬프 개별 / 결합 형광 이미지로 스택 파일로 만들 수 있습니다. </li></ol> 이미지의 프로세스와 단백질 및 현지화의 형광 부량 <ol><li> RFP 및 GFP 형광 필터를 일반 미디어 (NO 세포)로 이미지를 수집하고 배경 이미지로 저장합니다. 위에서 얻은 실제 데이터 이미지에서 빼기 이러한 이미지를 사용합니다. </li><li> RFP 및 GFP 이미지를 개별적으로 이미지의 스택을 준비합니다. </li><li> RFP 및 GFP의 형광 강도를 (BLT1 및 β - arrestin의 translocation) 측정하는 다양한 영역을 (표면 VS cytosolic)를 선택 / 정의 </li><li> 시간의 함수로 금액 형광 강도를 플롯. 이 그래프는 주어진 분자의 translocation의 동력학에 대한 정보를 제공합니다. </li></ol> 대표 결과 A. 측정 Leukotriene B 4 감독 돌기 세포 마이 그 레이션 이 프로토콜에서 설명한 방법은 leukotriene B 4 (그림 1과 연결된 비디오 1) 21쪽으로 돌기 세포 이주를 결정하는 데 사용되었다. 우리는 살아 세포에서 특정 리간드로 세포의 chemotactic 용량을 결정하기 위해 유사한 방법론을 적용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. 마우스 골수는 100 nm의 LTB 4 방향으로 돌기 세포 이주를 파생. 비디오 1. LTB 4 방향 BMDCs의 셀 마이 그 레이션 라이브. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Boddulrui_Video1.AVI">비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . B. 측정 GPCR (BLT1)와 Cytosolic 단백질 (β - arrestin) 상호 작용, 라이브 세포 Translocation 이 절차의 완료되면, 하나는 GPCR 신호 이벤트에 다음과 같은 정보를 얻을 수 있습니다. <ol class="lroman"><li> GPCR과 cytosolic 단백질과 핵의 현지화 (그림 2). </li><li> 리간드 유도 cytosolic 단백질 (이 경우에는 β - arrestin) (그림 3)과 표면 GPCR (이 경우에는 BLT1)의 상호 작용. </li><li> 막에 수용체 국제화 및 β - arrestin translocation의 속도론은 수용체 (그림 4) (Jala 외. 2005) 18과 함께 국제화 다음. </li><li> 하나는 라이브 세포의 리간드에 의존 수용체 활성화 상태를 (비디오 2 첨부) 확인하고 수용체 활성화 (Jala 외. 2005) 18 개입 중요한 주제이나 프로세스를 확인할 수 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. RBL - 2H3 세포에 BLT1 - RFP (A), β - arrestin - GFP (B), pNuc - CFP (C)의 표현. 패널 D.에 표시된 색상 결합된 이미지 <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 수용체와 β - arrestin의 리간드 유도 translocation. 세포의 형광 강도의 라인 스캔이 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2315/2315fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. 1 μm의 LTB 4시 또한 수용체의 내면화 및 β - arrestin translocation의 속도론. 형광 강도는 막과 세포의 cytosolic 위치에서 시간의 함수로 측정되었다. 1 μm의 LTB 4 이외에 BLT1 - RFP 및 β - arrestin - GFP를 표현하는 세포의 비디오 2 라이브 영상이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2315/Jala and Bodduluri_Video2.AVI">비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오</a>

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R., Haribabu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+analysis+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+in+live+cells.">Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells.</a> Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).</li><li>Del Prete, A., A, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+dendritic+cell+migration+and+adaptive+immune+response+by+leukotriene+B4+receptors:+a+role+for+LTB4+in+up-regulation+of+CCR7+expression+and+function.">Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function.</a> Blood. 109, 626-631 (2007).</li><li>Salogni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+A+induces+dendritic+cell+migration+through+the+polarized+release+of+CXC+chemokine+ligands+12+and+14.">Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14.</a> Blood. 113, 5848-5856 (2009).</li><li>Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+myeloid+dendritic+cells+from+bone+marrow+precursors.">Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors.</a> J Vis Exp. , (2008).</li></ol>

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라이브 셀 이미징들은 실시간으로 발생과 같은 특정 단백질의 기능과 상호 작용을 설명하는 강력한 도구입니다. 이 논문에서 설명하는 방법은 명확하게 LTB 4 돌기 세포의 빠른 마이 그 레이션을 일으킬 수 보여줍니다. 이러한 방법은 다양한 세포 유형 LTB 4 기능의 측면뿐만 아니라 확장, 그들은 유사한 방법을 다른 chemokines의 다양한 적용 및 다른 백혈구 하위 집단에 대한 chemotactic...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell lines:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>CRL-2256</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Media:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Delbecco's modified Eagle&#x2019;s Medium (DMEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11995</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol red free RPMI or DMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11835-030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25300</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES (1M)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Others:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>FD35-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>16552088</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Instruments/software:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gene Pulser II electroporater </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Metamorph Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Universal Imaging</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vertical Micro-pipette puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micro-Forge M-900</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hadraulic Micromanipulator MO-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coarse Manual Manipulator, MN-188NE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige International </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA constructs:</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td> cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (&beta;-arrestin1-GFP in present study).</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jala et al 2005</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

real-time imaging of leukotriene b4 mediated cell migration and blt1 interactions with &beta;-arrestin

G - 단백질 결합 수용체 (GPCRs)는 일곱 transmembrane 단백질 제품군에 속하는 및 세포내 반응하는 세포 신호 전달을 중재. GPCRs 제어 등 chemotaxis와 같은 다양한 생물 학적 기능, 세포내 칼슘 릴리스 heterotrimeric G - 단백질 1-2 통해 리간드에 의존적인 방식으로 유전자 규정. 리간드 바인딩은 순환 아데노신 monophosphate (CAMP), 이노시톨의 삼인산 (IP3)와 diacyl 글리세롤 (DG)로 두번째 사자의 수준을 조절 heterotrimeric G - 단백질의 활성화로 이어지는 conformational 변화 일련의 유도. 수용체 리간드 바인딩의 활성화와 함께 수반하는 또 desensitization, 격리 및 / 또는 국제화를 통해 신호 수용체를 자제하는 이벤트의 시리즈를 시작합니다. GPCRs의 desensitization 과정은 G - 단백질 수용체 kinases (GRKs)과 β - arrestins 3 이후 결합하여 수용체의 인산화 통해 발생합니다. β - arrestins은 cytosolic 단백질이며 수용체 내면화 4-6을 촉진하여가 (대부분의 경우) phosphorylated 수용체에 결합, GPCR 활성화에 막으로 이동시키다. 와 LTB 4 수용체 2 (BLT2, 낮은 친화 수용체, Leukotriene B 4 (LTB 4) GPCRs, LTB 4 수용체 1 (고친 화성 수용체 BLT1)을 통해 arachidonic의 산성 경로 및 mediates의 행동에서 파생된 프로 염증성 지질 분자이다 ) 7-9. LTB 4 BLT1 경로는 천식, 관절염 및 죽상 경화증 10-17, 등 여러 가지 염증 질환에 중요한 것으로 표시되었습니다. 현재 신문은 LTB 4 유도된 백혈구 마이 그 레이션 및 BLT1의 상호 작용 β - arrestin과, 현미경 이미징 기술을 사용하여 18-19 살 세포 수용체의 translocation을 모니터하기 위해 개발된 방법을 설명합니다. C57BL / 6 마우스에서 돌기 세포를 파생 골수는 격리 및 이전에 20-21을 설명한 교양되었습니다. 이러한 전지는 LTB 4 유도된 세포 마이 그 레이션을 보여주는 라이브 셀 이미징 방법으로 테스트되었습니다. 인간 BLT1는 녹색 형광 단백질 (β - 도착지 - GFP)로 태그가 C - 말단과 β - arrestin1에서 적색 형광 단백질 (BLT1 - RFP)를 지정하여 랫 Basophilic Leukomia (RBL - 2H3) 세포 라인에 plasmids 모두 transfected했습니다 18-19. 이러한 단백질 및 현지화 사이의 상호 작용 속도론는 라이브 세포 영상 현미경을 사용하여 모니터링할되었습니다. 현재 논문의 방법론은 라이브 세포에서 G 단백질 결합 수용체의 기능 반응을 조사하기 위해 미세 기술의 사용을 설명합니다. 현재 종이는 또한 수용체의 반응 속도론과 cytosolic 단백질 상호 작용을 결정하는 형광 강도를 정할 Metamorph 소프트웨어의 사용에 대해 설명합니다.

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Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

Leukotriene B의 실시간 영상 4 중재 셀 마이 그 레이션 및 β - arrestin로 BLT1 상호 작용

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

real-time-imaging-leukotriene-b4-mediated-cell-migration-blt1

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

12.7K 조회수.  University of Louisville. 본 논문은 특정 리간드에 leukocytes의 chemotactic 응답을 확인하고 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 세포 표면 수용체와 cytosolic 단백질 사이의 상호 작용을 식별하는 방법을 설명합니다.

비디오: Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &#946;-arrestin

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T 세포의 실시간 라이브 영상은 복잡한 형성을 신호

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

연구

면역학 및 감염병학

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

사용 모니터링 수지상 세포 이동<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H 자기 공명 영상

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

골수 세포 역학의 실시간 영상<em&gt; APC<sup&gt; 최소 / +</sup</em&gt; 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

실시간 이미징 및 2 단계 반복 흐름 시스템을 사용 하 여 곰 팡이 Biofilm 개발의 정량화

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

시험관 에서 미세 유체 질환 모델 전체 혈액 내피 상호 작용 및 혈전 역학을 실시간으로 연구

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

실시간 세포 분석을 사용하여 호스트 외부인플루엔자 바이러스 생존 모니터링

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration through the blood-brain barrier are indispensable steps for the development of E. coli meningitis. Reactive oxygen species (ROS) represent the major bactericidal mechanisms of neutrophils to destroy the invaded pathogens. In this protocol, the time-dependent intracellular ROS production in neutrophils infected with meningitic E. coli was quantified using fluorescent ROS probes detected by a real-time fluorescence microplate reader. This method may also be applied to the assessment of ROS production in mammalian cells during pathogen-host interactions.

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

Escherichia coli is the leading cause of neonatal Gram-negative bacterial meningitis. During the bacterial infection, reactive oxygen species produced by neutrophils play a major bactericidal role. Here we introduce a method to detect the reactive oxygen species in neutrophils in response to meningitis E. coli.

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...