우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.

참고 : 모든 동물 절차를 검토하고 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 1. 보관 (僞) 바이러스 <ol><li> 우리는 1 × 109 PFU / m의 역가에 프린스턴 대학에서 박사 린 Enquist의 실험실에서 라이브 바이러스 (PRV152)을 얻었다. 바이러스를 생성하는 2 프로토콜을 발표되었다. </li><li> 적절한 바이오 안전성 조건에서 -80 ° C에서 BSL-2 바이오 안전성 캐비닛과 가게 내부 튜브 당 20 μL에서 바이러스를 나누어지는. </li><li> 바로 주입하기 전에 PRV의 나누어지는을 녹여. </li></ol> 근육에 주사 2. 수술 준비 <ol><li> (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다. </li><li> 안과 연고와 각막을 보호합니다. </li><li> T 준비머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 수술 부위를 소독하여 무균 기술에 따라 그 수술 부위. 수술 영역을 커버하는 멸균 커튼을 사용하십시오. 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 준수해야합니다. </li><li> 피부 절개를 확인하고 관심있는 근육을 알 수있다. 예를 들어, 첫 sternohyoid 근육의 상부 부분을 제거 할 필요가있다 cricothyroid 후두 근육에 액세스한다. </li><li> VetBond 조직 접착제와 어떤 횡단 근육을 밀봉합니다. </li></ol> 근육에 PRV 3. 주입 <ol><li> 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, 갓 해동 PRV 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트. </li><li> 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 실린 팁을 종료 확인합니다. bioharzard 폐기물 등의 유체 폐기하십시오. </li><li> 정위 microp 사용ositioning 장치는주의 깊게 관심의 근육에 마이크로 실린 팁을 배치하고 약간의 붓기가 보일 때까지 천천히 근육을 입력합니다. 근육과 볼륨의 크기에 따라 달라질 분사량이 분사된다. 예를 들어, 4 NL / 초의 속도로 200 NL (1 μL 전체)의 다섯 주사 cricothyroid 근육을 채우기 위해 동일한 부위에 약 1 분 이격되어야한다. 관심 옆 근육 주사기 (여기서는 횡 cricoarytenoid)를 이동 및 주입 절차를 반복한다. 한 번만 각 근육에 구멍. </li><li> 5 분 후에 마이크로 실린 후퇴. </li><li> VetBond 조직 접착제를 사용하여 밴드의 틈을 밀봉합니다. </li><li> 모든 주사가​​ 완료된 후, VetBond 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫는다. 지역 institional 동물 사용 지침, 봉합이나 상처 클립에 따라이 사용될 수있다. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터하고 진통, 음식, 물을 제공하고, Y가 요구 신경우리의 기관 동물 사용 지침. </li><li> 실험적으로 결정된 생존 시간 후 (이 경우 90 시간이 2 라벨 ND 피질 뉴런을 주문하기 위해), 펜토 바르 비탈 과다에 의해, 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류. </li><li> 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정. </li><li> 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect. </li></ol> eGFP는 4. 면역 화학적 검출 <ol><li> 슬라이딩 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. 장착 섹션을 더럽히는 경우가 더 얇은 섹션, 30 μm의 예를 위해 사용될 수있다. </li><li> 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다. </li><li> PBS는 VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 염소 혈청 0.3 % 트윈 20을 포함하는 30 분 동안 섹션이 아닌 특정 항원을 차단 (키트를 VE). </li><li실온에서&gt; 품어 토끼에서 3.5 시간 동안 안티 - eGFP는 (1000 1) 섹션을 차단. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 염소 항 - 토끼 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오. </li><li> 0.05 % DAB (3, 3&#39;-미노)와 0.015 %의 H 2 O 2를 포함, 10 분 동안 인산 버퍼에 절을 세 번 씻어 인산염 버퍼에 8 분, pH가 7.4에 대한 개발. </li><li> 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %). </li><li> 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에. </li><li> 이미지 현미경에 장착 된 부분. DAB 반응 생성물 insid전자 세포는 갈색 나타납니다. 디지털화 된 이미지는 미세 공정을 강조 반전 색이 될 수 있습니다. </li></ol> PRV 추적에 의해 발견 된 뇌 영역으로 트레이서 사출 5. 수술 준비 <ol><li> (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다. </li><li> 안과 연고와 각막을 보호합니다. </li><li> 적절한 정위 프레임에 머리를 고정합니다. </li><li> 머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 사이트를 소독하여 무균 기술에 따라 수술 부위를 준비합니다. </li><li> 두피 절개를 확인하고 관심있는 뇌 영역을 통해 피부를 철회. </li><li> 해당 정위 좌표에 작은 개두술을 수행합니다. 예를 들어, PRV는 추적을 식별 laryngeally 연결 운동 피질의 좌표N 성인 마우스는 1.2 mm의 측면과 브레 그마 0.2 mm의 주동이 있습니다. </li></ol> 뇌에 바이오틴 덱스 트란 아민 6. 주입 <ol><li> 멸균 생리 식염수 333 μL에서 BDA의 25 밀리그램 (10,000 MW)을 용해하여 7.5 % 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)를 준비합니다. </li><li> 계획 주사에 대한 충분한 BDA 솔루션 Nanoject II의 마이크로 피펫 시스템을로드합니다. </li><li> 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 피펫 팁을 종료되어 있는지 확인합니다. </li><li> 마이크로 위치 정위 장치를 사용하는 것은주의 깊게 관심 뇌 영역에 마이크로 피펫 팁을 낮추고 BDA 천천히 주입. 영역의 크기에 따라 주사 속도가 표시되도록 조정한다. 예를 들어, 4.6 NL의 12 주사 떨어져 0.2 MM (rostro-꼬리 방향) 성인 쥐의 laryngeally 연결 운동 피질을 충당하기 위해 네 개의 다른 위치에있을 제작한다. 최종 주입 부피는 관심 뇌 영역의 크기에 따라 조정되어야레이블이 뇌 조직을 통해 레이블 뉴런의 과정을 따라 확산에 의해 주입 코어에서 확산 할 수 있음을 염두에두고. </li><li> 치과 용 시멘트를 이용하여 개두술을 밀봉하고 VetBond 조직 접착제를 이용하여 두피에 상처를 닫는다. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경. </li></ol> 근육 콜레라 독소 B 서브 유닛의 사출 7. <ol><li> 멸균 생리 식염수 100 ㎕에 CTB 1mg을 용해시켜 1 % 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 준비한다. </li><li> 엿새 동안 뇌에 BDA 주입 한 후, 근육에 PRV 주사에 대해 상술 한 바와 같이, 수술 준비를 수행합니다. </li><li> 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, CTB 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트. </li><li> 이전에 해제로 관심의 근육 (들)에 microinjections를 수행PRV에 대한 스 크라이 빙. </li><li> 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경. </li><li> 사흘 CTB 주입 후, 펜토 바르 비탈 과다하여 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류. </li><li> 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정. </li><li> 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect. </li></ol> 같은 섹션에서 BDA와 CTB 8. 검출 <ol><li> 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 다음 실온에서 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </리&gt; <li> 10 분 동안 인산염 완충액 섹션 세 번 씻고, 0.05 % DAB (3,3&#39;- 디아 미노 벤지딘), 0.015 %의 H 2 O 2, 및 0.05 %의 염화 니켈을 함유하는 인산염 완충액에서 8 분, pH가 7.4에 대해 개발한다. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검은 나타납니다. </li><li> VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 토끼 혈청 트윈 20 0.3 %를 포함하는 PBS에서 30 분 동안 차단 섹션. </li><li> 실온에서 : 품어 염소에 2 시간 동안 안티 CTB (10,000 1) 섹션을 차단. </li><li> 실온에서 키트를 VE에서 다음 토끼 항 염소 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다. </li><li> 다음 실온에서 ABC 용액에 30 분 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오. </li><li> 0.05 % DAB (3, 3을 포함, 10 분 동안 섹션을 인산염 완충액에 세 번 씻어 인산염 버퍼에 최대 8 분, pH가 7.4에 대한 개발&#39;-diaminobenzidine)와 0.015 %의 H 2 O 2. 세포 내부의 DAB 반응 생성물 갈색 나타납니다. </li><li> 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %). </li><li> 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에. </li><li> 이미지 현미경에 장착 된 부분. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염된 동물은 일반적으로하여 정상적인 동작의 관찰을 필요로하는 실험 PRV152의 유용성을 제한, 생존 기간 동안 질병의 징후를 표시합니다. 또한, PRV152는 세포 독성 면역 반응 (22)을 트리거합니다. 바이러스의 복제 및 전송 시간에 따른 4 titer-하고 있기 때문에, 신경의 패턴 비라의 면역 검출에 의해 밝혀세포는 감염의 단계를 통해 진행으로 L 단백질 또는 eGFP는 리포터 유전자는 생존 기간의 과정을 통해 변경됩니다. 다섯 일 근육에 접종 한 후, 3 번째, 4 번째 순서의 뉴런은 검출 될 수 있지만, 초기 감염 뉴런 사멸 될 수도있다. 따라서 최적의 생존 기간은 각각의 연구를 위해 실험적으로 결정되어야한다. 이는 회로를 통해 감염의 진행 및 세포 또는 동물을 죽음의 위험없이 관심있는 특정 뉴런 레이블을 가장 시점을 결정하기 위해 시계열 분석을 수행 할 것을 권장한다. PRV와 라벨의 성공에 영향을 미치는 가장 중요한 인자 중의 하나는 바이러스 역가이다. 1.4 X 10월 5일에서 7일까지 × 104 PFU / ㎖ 23 PRV-Bartha의 역가를 감소시키는 경우에 감염된 세포의 수가 현저히 감소가보고되었다. 따라서, 우리는 1 × 10 7 PFU / ㎖ 및 유지 분주 VI 이상 사용 역가 추천RUS가에서 -80 ° C ~ 그것의 감염성을 유지하기 위해 사용될 때까지. 높은 역가를 사용하는 경우에도, 하나는 모든 종류의 세포 감염에 대한 허용 될 수 있음을 유의하십시오. 따라서, PRV 추적에 의해 확인 된 세포는 감염된 대상에 대한 입력의 완전하게 대표하지 않을 수 있습니다. 한 방법은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 목표, 구체적으로 근육을 조절하는 중앙 efferents을 분석 PRV의 유용성에 초점을 맞추고있다. 그들은 또한 주변 접종에 의해 감염 될 수 있기 때문에 시각적 및 24와 같은 다른 자율 신경 회로는이 기술에 매우 적합하다. 그러나, PRV는 사전 검토 3에서 광범위 바와 같이 몇 가지 문제가주의 깊게 고려하면 중추 신경계로의 직접 분사를 위해 효과적으로 사용될 수있다. 그 저자는 PRV-Bartha 및 관련 균주가 광범위하게 identifyi에 대한 PRV152가 적합하다, 감염된 신경 세포의 수지상 아버을 채우기 언급NG는 말단 수상 돌기에 구 심성. 바이러스의이 속성은 일반적으로 기존의 추적자 공부하는 셀 바디 영역의 외부에있는 말단 수상 돌기에 입력 예비 목록을 추론에 대한 설명 기술은 특히 유용합니다. 주변 대상에서 추적 할 때, 교감 신경 분포가 가능한 혼동 고려되어야한다. 따라서, 우리는 처음에 공감 입력 PRV 라벨이 결과의 해석에 영향을 미칠 것입니다 여부를 결정하기 위해 정상 및 sympathectomized 동물의 라벨 패턴을 비교하는 것이 좋습니다. 면역 조직 화학에 대한 필요없이 형광 현미경을 이용하여 직접 묘화 될 수 PRV152 표현 eGFP는 감염된 세포에서의 신호; 그러나,이 신호는 사진 표백의 대상이며, 시간이 지남에 따라 저하됩니다. DAB는 요로 트레이싱 결합 면역 조직 염색의 주요 장점은 반응 생성물의 영구적 인 특성이다. 그것은 내가 동안또한 감염된 세포를 검출하는 바이러스 단백질에 대한 항체를 사용하는 것이 가능하다, 다른 바이러스 성 요소는 반드시 서로 25 또는 eGFP는 신호와 공동 지역화 않는다. 따라서, 우리는 형광에 의해 관찰 라벨 패턴을 유지하기 위해 eGFP는 대한 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 감염된 세포에 대한 모든 구 심성은 원위 수상 돌기에 문의하는 것이 포함하여 바이러스의 transsynaptic 통과를위한 도관 될 가능성이 있기 때문에, 우리는 중요한 확실하게 식별 회로 릴레이의 다음 확인을 위해 같은 수상 돌기 얼룩 기존의 추적을 선택하는 것으로 간주. 우리는이 목적을 위해, CTB를 선택하고,이 돌기의 양호한 염색 및 주변 neuropil와 운동 피질에서 내림차순 축삭 모두 강한 콘트라스트를 제공한다는 것을 발견했다. 이 염색 축색과 세포체의 착색 (BDA = 갈색; CTB = 검정색)을 반전 할 수 있지만, 우리는 블랙 최선 공동을 제공한다는 발견ntrast 좋은 구경 축삭을 시각화. BDA 라벨 패턴을 해석 할 때 명심해야 할 중요한 점은 BDA10kDa 주로 선행 성 추적자로 사용뿐만 아니라 역행 (그림 6) 6 셀 라벨을 할 수 있다는 것입니다. 또한, BDA는 다른 단말기 사이트에 축삭 담보를 따라 분포 셀에 역행 수송 할 수있다. 그 축삭 담보가 분사 영역의 투사 대상물과 동일한 영역에 존재한다면, 그것은 선행 성 라벨 구별하기 어렵다. 최종 기술 노트는 34 G NanoFil 금속 주사기, 좋은 구경보다 더 나은 수행 근육에 추적자를 주입 유리 피펫을 뽑아하지만, 작은 동물의 뇌내 주사에 사용하는 경우 너무 많은 기계적인 손상이 발생한다는 것입니다. 따라서 우리는 주변 주사에 대한 금속 주사기와 중앙 주사의 유리 피펫을 사용하는 것이 좋습니다.

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 &lt;에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP&gt;. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다. 신경 추적하는 바이러스를 사용하는 부가적인 이점은 감염된 세포 내에서 리포터 단백질 (이 경우 eGFP는)의 증폭이다. 이 신호 증폭에도 희소 돌기의 검출 감도의 허용 레벨을 제공한다. 예를 들면, 수염을 제어 안면 운동 뉴런에 vibrissa 모터 피질에서 희소 돌기 급속도로 표현 녹색 형광 단백질 (14)을 사용하여 래트에서 발견되었다; 이전의 연구는 리포터 유전자 증폭 11, 15 않고 고전 추적기를 사용하여이 투사를 찾지 못했습니다. 불행하게도많은 바이러스 추적 벡터는, 인용 된 연구에서 사용 된 것과 같은, 다중함으로써 시냅스 회로 추적을위한 이들의 사용을 제한하는, 시냅스 교차하지 않는다. 모터 회로에 참여하는 세포의 네트워크를 식별하기위한 고유 한 장점을 제시하고 있지만, transsynaptic의 분산 특성은 PRV-152 곤란 회로 내의 특정 연결을 해석하게하여 추적. 따라서, 우리는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 사용하여 이중 라벨에 의해 PRV-152을 사용하여 식별 회로 내의 특정 연결을 검증하기위한 간단한 방법을 제시한다. BDA와 CTB의 병용은 신경 6-8,11의 특정 세트 사이의 연결을 추적하는 잘 확립 된 방법입니다. 함께 사용되는 경우, 이들 두 추적자 2 색 DAB (3,3&#39;- 디아 미노) 프로 시저 (16)를 사용하여 동일한 구역으로 시각화 될 수있다. 고 분자량 BDA (BDA10kDa)은이 프로토콜을 선택한 것이 Y 때문에신경 과정 6, 7의 상세한 라벨을 ields. BDA10kDa의 추가 장점은 다음과 같습니다 :이 우선적으로 선행 성 방향 6-8로 운송된다; 이는 이온 삼투압 또는 압입 6-8에 의해 전달 될 ​​수있다; 그것은 단순한 아비딘 - 바이오틴 HRP (ABC) 프로 시저 (17)에 의해 시각화 될 수있다; 그것은 빛 또는 전자 현미경 6,7,18에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이 원위 수상 돌기 10,19 포함 세포 과정을 공개 효과적이기 때문에 퍼 옥시 다제 및 DAB와 CTB의 면역 화학적 검출의 motoneurons의 역행 라벨 선택되었다. 우리는 최근 생쥐의 보컬 모터 경로를 확인하고 이전에 20 부재로 가정 된 후두 운동 신경, 1 차 운동 피질에서 스파 스 연결을 나타 내기 위해이 방법을 사용했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3&#39;- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.

eGFP는 위해 염색하는 것은 근육에 PRV152를 주입 한 후 일차 운동 뉴런에 약 72 시간을 약한 신호를 보여주는 시작해야한다. 복제 및 바이러스의 transsynaptic 교통 titer-과 시간에 따라 4입니다. 약 90 시간 주입 후, eGFP는 염색은 2 차 순서에 감염된 세포에 강력한 신호를 공개합니다. 긴 생존 시간은 3 차 및 고차 세포를 공개하지만 생존 시간은 약 오일 접종 후 PRV의 치사에 의해 제한됩니다. 그림 1a는 PRV152는 후두 운동 신경, 일곱 후두 근육의 두 가지로 PRV152의 주사 후 94 시간 주택 핵 ambiguus에 eGFP는 표현에 감염된 신경을 보여줍니다. 바이러스가 감염된 근육, 같은 설하 핵 다른 phonatory 운동 신경 풀을, 신경을 분포시키다 신경을 통해 뇌에 입력하기 때문에, eGFP는을 표명하지 아니합니다 (그림 1b). <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 그림 2는 핵 ambiguus에서 차 감염 이후 2 차 주문 뇌간 신경 세포에 바이러스의 역행 전송을 보여줍니다. 주입은 일방적이고, 뇌간에서 라벨의 결과 패턴은 동측 핵 ambiguus과 고독한 핵 (그림 2a)의 감염을 보여줍니다. 망상의 interneurons 또한 감염 eGFP는 (그림 2b)에 대해 강하게 염색 하였다. 이들의 interneurons는 phonatory 모터 신경 풀과 반대측 핵 ambiguus 등 다양한 구조를 연결; 바이러스는 단지 역행 방향으로 확산하기 때문에, 그들의 원심성 대상 표지 된 남아있다. 도 3은 주사 부위 주변에 eGFP는 반대측의 발현 운동 피질에 감염된 전 운동 뉴런을 나타낸다. PRV152이 핵 ambiguus에서 후두 운동 신경에 충돌 다중 시냅스 회로를 통해 확산 때문에, 수 bE는 후두 근육의 운동 피질 표현을 구성하는 세포의 집단이 감염된 것으로한다. (그리고 전뇌의 대부분은 도시되지 않음) 도시 섹션의 나머지 eGFP는 신호의 결여는 표지의 특이성을 보여준다. 그림 4는 핵 ambiguus의 수준에서 뇌간에 축삭을 BDA가 표지이다. 축삭은 역행 후두 근육에 주사하여 표시된 CTB 양성 운동 신경과의 접촉을합니다. 축삭은 후두 운동 신경의 정맥류와 수상 돌기 근처 추정 터미널 튼스와 소마를 형성 표시됩니다. 전자 현미경 또는 전기 생리학을 사용하여 추가 실험은 이러한 정맥류가 시냅스 튼스를 나타내는 여부를 결정해야합니다. 도 5a는 PRV152으로 추적 역행 transynaptic에 의해 식별 laryngeally 연결 운동 피질에 배치 BDA의 양자 주입을 보여줍니다. 벡<html> ause BDA는 모두 구 심성 및 원심성 연결이 표시 될 수 있으며, 방향성 특정하지 않습니다. 예를 들어, 투영 영역 (선행 성) 및 세포 기관 모두 (역행) 라벨 시상에 보인다 (도 5b). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50672/50672fig1.jpg" /> 그림 1 : PRV152은 () Ambiguus AMB ()에 eGFP는 (녹색)과 콜린 아세틸 면역 양성의 motoneurons (적색) 표현에 감염된 뉴런 및 (b)에 PRV152의 주입 후 마우스 뇌간 94 시간의 설하 (XII) 핵 Cricothyroid 및 측면 Cricoarytenoid 후두 근육. RF = 망상 형성. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50672/50672fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <html> g2.jpg &quot;/&gt; 그림 2 :. Cricothyroid 및 측면 Cricoarytenoid 후두 근육에 PRV152을 주입 한 후 마우스 86 시간의 뇌간에 Psuedorabies 바이러스 (PRV152) 감염 () 뉴런이 강화 된 발현하는 녹색 형광 단백질 (흰색, 스테인드 섹션의 원래 시야 이미지에서 반전 된 색상 ) 주입 된 근육에 핵 ambiguus AMB () 동측에, 주변의 망상 형성 (RF)와 고독한 핵 (솔),하지만 설하 핵 (XII). (B) 암브 높은 배율에서 망상의 interneurons (빨간색 화살표, RF의 세포 기관). 스케일 바 : 대한 1mm; B 100 μm의. (Arriaga 등. 2012 년 수정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50672/50672fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> tp_upload / 50672 / 50672fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 :. 두피 피라미드 뉴런은 eGFP는 (흰색, 스테인드 섹션의 원래 시야 이미지에서 반전 색) 표현 Cricothyroid과 측면 Cricoarytenoid 후두 근육에 Psuedorabies 바이러스 (PRV152)의 사출 다음 (M1)의 피질 레이어 V의 크기를 조절 바 : 1mm에 대한 메인 패널; 삽입 된 200 μm의. (Arriaga 등 알에서 수정. 2012). <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50672/50672fig4.jpg" /> 그림 4 :. 뇌간에서 M1 축삭 () (M1)에 BDA의 주입에서 후두 근육과 M1의 축삭 (검은 색)의 주입에서 암브 (갈색)에 CTB 표지 운동 뉴런을 포함하는 관상 뇌간 부분의 낮은 전력. BDA 표시 축삭은 cortico-피라미드 (피리) 트랙에서 볼 수 있습니다. 요약 : 암브, 핵 ambiguus; 피라, 피라미드; MRF, Reticular 형성은 직접 암브에 내측; DRF, 암브에 망상 형성 지느러미. (b)는 BDA의 높은 배율 암브 모터 뉴런 (CTB 갈색)에 접촉 (화살표)를 만드는 (M1)에서 축삭 (검정, 화살표 머리)를 표시. (C) (M1)의 축삭 (검정) (화살표)를 따라 실행하고 근처 (화살표 머리) 암브로부터 방출 큰 암브 모터 신경 세포 수상 돌기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50672/50672fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/50672/50672fig5.jpg" /> 그림 5 : 주사 부위와 PRV의 transynaptic 추적으로 보지 BDA 주사에 의해 밝혀 추가 양방향 연결. () 일차 운동 피질 (M1)의 양자 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA) 주사 (블랙) 기본 선조체의 밀도 터미널 투사 필드 (검정색) 밝혔다. (b) 코르티(M1)에서 CAL 축삭은 시상 (VL)의 복부 측면 핵에 종료; 시상 세포의 클러스터 (어두운 갈색과 흰색 화살표 머리로 표시) 다시 M1 노래 영역에 해당 프로젝트는 VL에서 관찰된다. 내부 캡슐 (IC)는 피질에서 나오는 축삭을 표시했다. 스케일 바 : 대한 1mm; B 200 μm의. (Arriaga 등. 2012 년 수정). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50672/50672fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K 조회수.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

비디오: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

레이저 유도 신경 세포의 추적에서 뇌 외식

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

높은 분자량 Biotinylated Dextran 아민 Thalamocortical 프로젝션 쥐에 추적에 대 한 응용 프로그램 향상

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...