터너 증후군은 완전히 또는 부분적으로 누락된 X 염색체와 관련되었던 희소한 상태입니다. 증후군은 불모, 짧은 키, 심장 혈관 무질서 및 신경 인지 결점을 특징으로 합니다. 어떤 경우에는 태아의 죽음을 일으킵니다.
aneuploid 태아의 체세포는 생물학적으로 가치가 있지만, 그들은 짧은 수명이기 때문에 연구에서 사용을 제한합니다. iPSC의 생성은 따라서 aneuploid 특성의 영구적인 보존을 위한 세포 준비의 효과적인 방법입니다. 그(것)들은 자기 갱신하고 초기 배아 발달을 연상시키는 특화된 세포 모형으로 분화할 수 있습니다.
핵 소설을 통해 비통합 에피오피 리프로그래밍 플라스미드를 전달하는 것은 완전히 재프로그래밍되고 안정적인 iPSC를 생성하기 위한 효율적이고 재현 가능한 방법입니다. 이 방법은 프로그래밍하기 어려운 세포에서도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 골수 물질에서 iPSC의 재생을 설명합니다.
수집된 태아 안무빌리를 멸균 페트리 접시에 옮기세요. 1X 항생제 항mycotic 용액을 함유한 PBS로 여러 번 세척하십시오. 파이펫팅으로 PBS를 완전히 제거합니다.
콜라게나아제 블렌드 1ml를 빌리에 넣고 섭씨 37도에서 10분간 또는 조직이 붕괴될 때까지 배양합니다. 인큐베이션 후, 10%의 태아 소 세럼을 함유한 미디어를 추가하여 콜라게나아제를 중화시한다. 페트리 접시의 내용물들을 15ml 튜브로 옮킨다.
분산된 비방과 방출된 세포를 수집하기 위해 소화를 원심분리합니다. 신중하게 상체를 장식합니다. 플레이트는 T25 배양 플라스크 및 AmnioMAX 배지에서 방출 된 세포와 함께 담소하고 수렴 섬유 아세포 배양을 얻을 때까지 성장한다.
섬유아세포와 문화를 확장하여 후속 형질 및 특성화 실험에서 사용할 주식을 준비합니다. 재프로그래밍 플라스미드를 포함하는 알칼리의 문화를 준비한다. 제조업체의 지침에 따라 미디 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드를 분리합니다.
밀리리터당 1 마이크로그램의 최종 농도를 얻기 위해 DNAse RNAse 무료 물의 적당한 부피에서 각 팔레트를 다시 중단합니다. 제조업체의 지침에 따라 ECoR1 제한 소화 키트를 사용하여 플라스미드를 확인하십시오. 융모성 사악한 섬유아세포를 트립시닉합니다.
세포를 수집하기 위해 중화하고 원심분리기를 분리합니다. 상체를 데캔트하고, 5ml OPTI-MEM에서 세포를 다시 중단한다. 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 핵을 위한 1백만 개의 세포를 제거합니다.
세포 팔레트를 얻기 위해 원심 분리기. 아맥사 NHDF 중성화기 키트를 사용하여 핵을 수행한다. 키트에 제공되는 0.5mL 보충제와 2.25 mL 핵치료제용액을 혼합하여 중성성 시약을 준비한다.
핵제염 용액 100마이크로리터를 제거하고 각 플라스미드의 마이크로그램 1개를 추가합니다. 이 믹스에서 1백만 개의 세포를 부드럽게 다시 일시 중단합니다. 세포 DNA 현탁액을 큐벳으로 옮기면 시료가 기포 없이 큐벳의 바닥을 덮도록 합니다.
큐벳을 캡하고 홀더에 삽입합니다. 고효율을 위해 핵액터 프로그램 D-23을 선택하고 적용한다. 홀더에서 큐벳을 제거하고 AmnioMAX 미디어 1mL을 추가합니다.
키트에 제공된 파이펫을 사용하여 페트리 접시를 치료한 조직 배양으로 내용물들을 부드럽게 전달합니다. 가습 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다. 10 일 동안 AmnioMAX 배지에서 세포를 유지 한 다음 20 일 동안 흉부 배지로 이동합니다.
iPSC 확장을 위해, 당겨진 유리 파이펫을 사용하여 재프로그래밍 접시에 형성된 배아 줄기 세포와 같은 콜로니를 수동으로 해부한다. iPSC를 적절히 전파하고 5~7일마다 마사지하십시오. iPCSs는 자발성 마커 알칼리성 인산염에 대해 양성이었다.
iPSC 식민지를 작은 조각으로 절단하고 배아 체 배지에서 낮은 애착 페트리 접시에 도금하여 배아 체를 생성합니다. 이포데르름 분화는 이외 분화 배지에서 4일째 배아체체를 도금함으로써 유도된다. 유사하게, 중피 분화는 중피 분화 배지에서 8일째 배아체체를 도금함으로써 유도된다.
엔도름 분화를 유도하기 위해, 배양 iPSC는 단층에서 단층으로 분화 매체. 섬유아세포에 있는 형태학적 변화는 재프로그래밍하는 과정을 통해 감시되었다. 그들은 상피 세포 와 같은 형태를 표현하고 소형 식민지를 형성했다.
세포는 또한 배양에 있는 다능성 세포의 전형적인 세포질 비에 높이 핵이 있었습니다. iPSC는 45개의 XO 캐리어 유형을 보유하고 있으며 104, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 및 E-CADHERIN에 대해 양성 반응을 나타나았다. 세포는 대표적인 세균 층 마커를 위해 염색되었습니다.
터너 증후군은 이렇게 신경 인지 적자를 개발합니다. 터너 증후군 iPSC에서 파생 된 뉴런은 우수한 모델이 될 수 있습니다. 이것은 일반적인 해리 터너 증후군의 새로운 라인을 이해하기 위하여 페트리 플레이트에서 모델링됩니다.
