We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.

이 프로토콜 및 비디오보다 상세하게 사에 소프트웨어 패키지를 설명하는 원래의 종이 동반자뿐만 아니라 Danuser 연구소 웹 사이트에서 소프트웨어 다운로드와 함께 제공되는 기술 보고서의 역할을하기위한 것입니다. 독자는 소프트웨어를 사용에 대한 추가 질문이있는 경우주의 깊게 문서를 검토하는 것이 좋습니다. 1 이전 이미지 분석에 <ol><li> TIFF (태그가 지정된 이미지 파일 형식) 이미지 파일의 시퀀스로 각 시간 경과 영화를 변환 할 수 있습니다. 여러 성장 콘 / 세포가 특정 영화가있는 경우, 첫째 작물 각 성장 콘 / 셀은 자신의 이미지 시퀀스를 만들 수 있습니다. 참고 :이 필요하지 않습니다, 개별 지역 -의 - 관심 (ROI)을 plusTipTracker 내에서 선택 될 수있다. 그러나, 작은 화상 사이즈를 사용하여 연산 처리의 속도를 증가시킨다, 그래서 이미지에 상당한 빈 공간이있는 경우에는이 단계를 권장합니다. </li><li> 자신의 각 TIFF 시리즈를 저장MATLAB이 액세스 설정 경로 내에서 &quot;이미지&quot;라는 폴더 ( &quot;이미지&quot;대소 문자를 구분되어 있습니다). &quot;현재 폴더&quot;창에서 해당 파일 디렉토리에 새 경로를 추가 이동하려면 디렉토리 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 &quot;경로 추가 - 선택된 폴더 및 하위 폴더&quot;를 선택합니다. 그것은 plusTipTracker 소프트웨어 폴더뿐만 아니라, 경로에 추가하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2 plusTipGetTracks 주 : 화상 해석의 첫 번째 단계는, EB1-GFP를 검출 혜성 혜성 트랙에 연결 한 미소 관 역학 파라미터를 결정하는 것이다. 이것은 명령어 &quot;plusTipGetTracks&quot;4로 얻어진다. <ol><li> 분석, 오픈 MATLAB 응용 프로그램을 시작하고 명령 창에 &quot;plusTipGetTracks&quot;를 입력합니다. 이 새로운 대화 상자가 나타날 수 있습니다. </li><li> &quot;최대 신규 프로젝트 설정&quot;을 클릭하고 하나 (또는​​ MOR을 선택e)에 해당하는 &quot;이미지&quot;폴더 (또는 &quot;이미지&quot;폴더)를 포함하는 디렉토리를 선택하여 이전 TIFF 이미지 시리즈의. 이 단계가 완료되면, 파일 디렉토리 (roi_1) ( &quot;이미지&quot;를 보유하고있는 동일한 폴더)가 생성 될 미래의 데이터 파일을 포함하는 것이다. 참고 : &quot;설정 신규 프로젝트&quot;단계는 별도의 세션 동안, 사전에 완료 할 수 있습니다. </li><li> &quot;마지막 지점을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭, 다각형을 선택하고 &#39;마스크 만들기&#39;를 클릭&quot;새 창이 나타납니다. &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 선택한 이미지 시리즈의 첫 번째 이미지는 표시됩니다. 클릭하고 성장 콘의 전체를 포괄하는 다각형을 만들기 위해 마우스를 사용합니다. 두 다각형을 닫으려면 마우스를 클릭합니다. </li><li> 다각형이 폐쇄되면, 대화 상자가 나타납니다 : &quot;다른 투자 수익 (ROI)을 선택 하시겠습니까?&quot;이미지가 &quot;예&quot;를 선택 분석 할 수있는 또 다른 성장 콘이있는 경우; 그렇지 않으면이야당선자 &quot;아니오&quot;. </li><li> 즉시 분석 할 프로젝트를 선택합니다. &quot;프로젝트 선택&quot;을 클릭하고 분석하는 폴더 (roi_X)을 선택합니다. </li><li> listSelectGUI 화면이 나타납니다. 화면의 왼쪽으로부터 프로젝트 (들)을 선택하고 화면의 오른쪽으로 위로 이동한다. &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 프로젝트 목록을 저장하고 &quot;저장&quot;을 클릭 할 수있는 위치를 선택합니다. </li><li> &quot;탐지&quot;, &quot;추적&quot;및 &quot;사후 처리&quot;를 선택합니다. 이러한 선택이 이루어지고 나면, 대화 상자의 오른쪽은 구성이 될 것입니다. 각 옵션을 구성합니다. <ol><li> 이러한 매개 변수는 MT의 트랙으로 감지 혜성을 연결하는 데 사용됩니다. 추적이 제어 매개 변수 선택을위한 세부 사항은 페이지 소프트웨어 패키지를 다운로드하면 함께 제공되는 기술 보고서​​의 PDF의 9 ~ 10에 포함되어 있습니다; 문제가 발생주의 경우이 보고서를 읽어보십시오. Xenop에 EB1-GFP 혜성의 추적의 목적우리가 성장 콘 사용 laevis의 다음 추적 설정 : 검색 반경 범위 (픽셀) 5-12, 최소 서브 트랙 길이 (프레임) 3; 최대 갭 길이​​ (프레임) 8; 최대 수축 계수 0.8, 최대 각도 앞으로 50, 최대 각도 뒤로 10, 변동 반경 2.5. 이러한 설정은 그림 1에 나타내었다. </li></ol> 참고 : 최대 수축 팩터는 &quot;뒤로 갭&quot;으로, 검출 된 &quot;후방 갭&quot;의 수를 줄이기 위해 설정된 트랙 결합에 혼잡 조건으로 주어진 에러 가능성, 성장 원추의 문맥에서 분석하는데 유용하지 않다. 성장 원뿔 이동 단말은 성장과 수축에 부가 작은 빈번한 전좌를 나타내고, 이들 제어 설정을 늘리면 결합하는 단계에서 증가 된 이동을 허용하는 부가 적으로, 모두 최대 순방향 각도뿐만 아니라 변동 반경은 비교적 높게 설정된다. <ol><li> 원하는 특정 이미지 수집 설정에 따라 사후 처리 설정에서 입력합니다. </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 설정이 구성되고 나면, &quot;시작&quot;을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 선택되었습니다 중 설정이 실행됩니다. 이 사업을 추진과 크기의 수에 따라 시간 분 정도 걸릴 수 있습니다. 명령 창은 각 기능의 남은 예상 시간이 표시됩니다. plusTipGetTracks 단계가 완료되면, 명령 윈도우는 &quot;완료!&quot;를 표시 할 것이다 참고 : 미크론 (MT 역학의 특정 매개 변수가 지금이 소프트웨어에 의해 계산 된의 긴 목록 (자세한 내용은 참고 4 참조)하지만, 성장 콘에서 MT 역학의 분석, 검토 할 수있는 가장 유용한 매개 변수 MT 성장 궤도 속도 아르 / 분), 초 성장 트랙 수명 () 및 마이크론의 성장 트랙 길이 (). </li></ol> 3 plusTipSeeTracks 참고 : 이제 미세 소관 트랙이 정의되어 있는지, 함수 &quot;plustipSeeTracks는&quot;트랙 시각화 4에 사용됩니다. 이 기능공간 MT 역학지도와 속도 영화를 포함하여 시각화를위한 다중 출력을 제공하지만, 여기에 초점이 성장 콘의 이미지에 중첩 MT 트랙을 표시하려면 &quot;트랙 영화&quot;를 사용하여에만입니다 수 있습니다. plusTipGetTracks가 동시에 여러 동영상을 분석 할 수 있지만, plusTipSeeTracks는 한 번에 하나의 동영상을 분석 할 수있다. <ol><li> 명령 창에 &quot;plusTipSeeTracks&quot;를 입력합니다. </li><li> 대화 상자를로드 한 후, &quot;프로젝트 선택&quot;을 클릭합니다. 시각화하고 &quot;폴더 선택&quot;을 클릭하여 프로젝트를 포함하는 상위 디렉토리를 선택합니다. 새 창이 나타납니다 : &quot;시각화 할 프로젝트를 선택합니다.&quot; 시각화하고 &quot;확인&quot;을 클릭하여 파일을 선택합니다. </li><li> 다음, &quot;선택 저장 ROI&quot;를 클릭하십시오. 이전 단계에서 선택한 것과 동일한 roi_X 폴더로 이동하고 &quot;roiYX&quot;라는 이름의 파일을 선택합니다. </li><li> w 지정 &quot;출력 디렉토리를 선택&quot;을 클릭하여여기에 MATLAB 트랙 시각화 파일을 저장합니다. 참고 : 우리는 나머지 데이터가 들어있는 동일한 폴더를 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 선택 &quot;트랙 영화를 만들기&quot;및 화면 + 팁 혜성에서 계산 된 트랙 plusTipGetTracks의 모든 표시가 나타납니다. 이 단계는 파일 &quot;allTracks_X_X_X&quot;에서, 동영상 포맷 추적 시계열을 저장한다. AVI 등의 동영상을 저장할 수있는 옵션이 다른 기본 형식은 Quicktime.mov 파일로입니다 있습니다. </li></ol> 4 plusTipGroupAnalysis 참고 :이 마지막 기능은 분석과 MT 트랙 매개 변수의 비교를 위해 영화의 그룹을 만드는 데 사용됩니다. <ol><li> 명령 창에 &quot;plusTipGroupAnalysis&quot;를 입력합니다. 수동으로 비교 그룹을 선택하려면 첫째 &quot;계층에서 자동 그룹&quot;을 선택 취소합니다. 그런 다음, &quot;선택 프로젝트&quot;를 클릭하십시오. 모든 roi_X 폴더를 포함하는 상위 디렉토리로 이동분석합니다. </li><li> listSelectGUI 화면이 나타납니다. 화면의 좌측에서 그룹에 포함하고 화면의 오른쪽으로 위로 이동하는 모든 프로젝트를 선택한다. &quot;확인&quot;을 클릭합니다. 프로젝트 목록을 저장하고 &quot;저장&quot;을 클릭 할 수있는 위치를 선택합니다. </li><li> 창이 나타납니다 : &quot;목록에서 첫번째 그룹을 선택하십시오.&quot; &quot;확인&quot;을 클릭합니다. listSelectGUI 창이 다시 표시됩니다. 이 시간 함께 풀링해야 첫 번째 그룹에 해당하는 파일 만 선택합니다. &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> 그런 다음 그룹 이름을 입력하고 &quot;OK&quot;를 클릭하십시오. 그에 따라 답변 및 그룹을 계속 선택 &quot;다른 그룹을 선택?&quot;창이 나타납니다. 창이 나타납니다 : &quot;그룹 목록을 저장하는 위치를 선택합니다.&quot; 위치로 이동하고 &quot;저장&quot;을 클릭합니다. </li><li> 출력 폴더에있을 것이다 선택 &quot;을 선택 출력 디렉토리&quot;를 클릭합니다저장. </li><li> 실시 기 분석의 종류를 선택 - MT 트랙 수행되어야 각 그룹 또는 세포 분석 당 풀링할지 여부. 권장 통계 시험은 이미 지정되어 있습니다. 분석에서 모든 트랙을 포함하려면 해제를 - 선택 &quot;영화의 시작 / 끝에서 트랙을 제거합니다.&quot; 그렇지 않으면, 선택이 상자를 갖는 동영상이 시작 또는 끝으로 과정에있는 모든 MT 성장 트랙을 제거합니다. </li><li> 그룹 분석 선택이 설정되면, &quot;그룹을 비교&quot;를 선택합니다. </li></ol>

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	<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+(end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein).">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit/MAST/CLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance.">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li><li>Purro, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics.">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels.">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li><li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth.">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22 (2013).</li><li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+(XCLASP1)+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules.">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

PlusTipTracker 신속하고 자동으로, 또는 세포 성장 원뿔 거의 모든 가시 EB1-GFP를 검출 혜성 혜성 트랙으로 링크 및 MT 파라미터를 계산하는 단순한, 그래픽 사용자 인터페이스를 제공한다. 다른 게시물은 (. 예를 들어, 마르크스 등 성장 콘 (18)의 태그 EB1 역학도 활용 정량 분석) 소프트웨어의 유사한 형태의 디자인이 신고되었습니다. 그러나,이 소프트웨어는 자유롭게 오픈 소스를 설계 ...

이 방법의 목표는 정량적 인 미세 소관 (MT)에 관한 정보 플러스 - 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 성장 콘 생활의 역 동성을 획득하는 것입니다. MT + 팁은 이동 단말 9,10의 플러스 끝에 지역화 단백질의 그룹입니다. 그들은 중합, 재앙, 그리고 구조의 비율을 포함하여 MT 동적 불안정성 (11)의 매개 변수를 조절하는 다양한 기능을 수행합니다. MT 역학을 분석 한 잘 사용하는 방법은 성장 MT에 특이 적으로 결합 플러스 종료 1,12을 + 팁 EB1의 동작을 추적하는 것입니다. EB1은 성장 MT에 여러 개의 다른 단백질을 모집하는 것으로 알려져 플러스가 종료 MT 성장과 재앙 주파수 (15, 16)를 모두 촉진, 13, 14, 그리고 최근 MT 성숙 요인 15으로 설립되었습니다됩니다. 성장 콘 내에서 MT 역학의 많은 연구 EB1의 localizati로, 시간이 1 ~ 3 위에 EB1-GFP 역학의 변화를 측정하기 위해 손으로 추적 방법을 활용 한MT에게 플러스 단부 MT 중합 용 마커로서 사용될 수있다. MT 성장을위한 프록시로서 EB1-GFP 혜성 검사 용 주요 이점은 MT 역학 심지어 상당한 MT 오버랩 영역에서 측정 될 수 있다는 것이다. 손 추적 EB1-GFP 혜성의 방법은 MT에 유용한 통찰을 제공 하였지만 그것이 시간 소모적이며, 바이어스 될 수 있고, 행동들 1-3. 중요한 정보를 놓칠 수 있습니다 또한, 비정상적인 성장으로 콘 행동 가능성 (손으로 추적 할 때 일반적으로 필요한) 이동 단말의 일부만을 분석 골격 역학에 분 변화의 결과이다. 따라서, 우리는 높은 - 해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5 태그 EB1의 라이브 화상의 취득 후, 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 4를 사용하여 글로벌 MT 역학 파라미터를 측정한다. Danuser 연구소에서 개발이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화 여러 연구에 사용되었다. 그것은 우리를 오픈 소스입니다어 친화적 인 형광 표지 + 팁의 영화에 대한 자동 탐지, 추적, 시각화 및 분석을 포함 MATLAB 기반의 패키지로 제공된다. MT 역학의 특정 매개 변수가이 소프트웨어에 의해 계산됩니다의 긴 목록 (자세한 내용은 참고 4 참조)하지만, 성장 콘에서 MT 역학의 분석을 위해, 가장 유용한 매개 변수 (미크론 / 분) MT 성장 궤도 속도 아르, 성장 트랙 (초) 수명, 및 (미크론)의 성장 선로 길이. 소프트웨어 ( &quot;소프트웨어&quot;에서) Danuser 랩 웹 사이트에서 직접 다운로드 할 수 있습니다. Danuser 연구소는 현재 원래의 독립형 소프트웨어를 사용 가능한 상태로 유지하는 소프트웨어 패키지라고 불리는 U-트랙 2.0에 통합되어 + TIP 추적 분석을위한 새로운 인터페이스를 지원한다. 두 프로그램 사이의 기본 알고리즘은 인터페이스 및 분석 출력 만 차이, (적어도 2014 년 기준)와 동일하다. MATLAB 작은 및 / 또는 계산과 분석 체험관 초보자 용줬어은 plusTipTracker는 자동화 된 통계 매개 변수의 출력을 포함하여보다 사용자 친화적 인 기능을 가지고 있습니다. 여기서 우리는 배양 Xenopus의 laevis의 성장 콘에 EB1-GFP 역학의 이미지를 분석하는 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 MT 역학 (17)을 조사 최근 논문에서 사용되었다. 또한 로워 외를 참조하십시오. 2,012 5 EB1-GFP를 표현 배양 성장 콘에 대한 자세한 설명은. 이 논문은 주로 성장 원추의 EB1-GFP 역학 조사에 집중하지만, 동일한 프로토콜이 다른 세포 유형 (17)에 사용될 수있다. 모든 세포 유형의 경우, 프레임 간의 시간 간격은 최적의 TIP + 추적을위한 0.5-2 초 사이에 있어야한다. 프레임 간의 최대 4 초의 시간 간격이 가능하지만, 이것은 추가적인 추적 오차의 시간 간격 결과 증가 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">plusTipTracker software</td>
			<td style="width:116px;">Danuser Lab</td>
			<td style="width:345px;"><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td>
			<td style="width:172px;">This software may be hosted by another website in the future.&#160; If the listed site does not exist, search &#34;Danuser Lab Software&#34; on a web search engine to find the site.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Matlab software</td>
			<td style="width:116px;">Mathworks</td>
			<td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using plustiptracker software to measure microtubule dynamics in xenopus laevis growth cones

미세 소관 (MT) 플러스 - 엔드 추적 단백질 (+ 팁) 이동 단말의 증가 플러스 끝에 지역화 및 MT 역학 1,2를 조절한다. MT 역학 분석에 가장 잘 알려지고 널리 이용 + 팁 중 하나는 모든 MT 성장 플러스 단부에 결합 최종 결합 단백질, EB1,이며, 따라서, MT 중합 한 마커이다. 성장 콘 내의 EB1 동작의 많은 연구는 개별적인 이동 단말 1-3를 분석 시간과 바이어스 된 컴퓨터 보조 손 추적 방법을 이용했다. 우리의 접근 방식은 고해상도, 배양 된 배아 성장 콘 5에서 태그 EB1의 라이브 이미지의 취득 다음 소프트웨어 패키지, plusTipTracker 사를 사용하여 MT 역학의 글로벌 매개 변수를 정량화하는 것입니다. 이 소프트웨어는 형광 표지 된 팁 + 영화 자동 감지, 추적, 시각화 및 분석을 결합 MATLAB 기반, 오픈 - 소스, 사용자 친화적 인 패키지. 여기서는 plusTipT를 사용하기위한 프로토콜을 제시배양하여 Xenopus laevis의 성장 콘에서 형광 표지 + 팁 혜성의 분석을위한 racker. 그러나,이 소프트웨어는 다양한 세포 유형 6-8 MT 동력학을 특성화하는데 사용될 수있다.

여기에 설명 된 살아있는 세포에서 + TIP 역학을 정량화 여러 가지 정보 파일을 제공하므로이 소프트웨어를 사용. 함수 plusTipGetTracks는 (도 1에 도시 된 예시적인 설정을 사용하여) 트랙을 식별하고 + TIP의 트랙에 관한 매개 변수를 제공한다. 소프트웨어가 획득 한 것을 정보를 보려면 단계 2.2에서 만든 roi_X 디렉토리로 이동합니다. &quot;공적&quot;폴더가 검출 된 혜?...

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Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

MATLAB 기반, 오픈 소스 소프트웨어 패키지, plusTipTracker은 미세 소관 역학 정량화 형광 - 표지 + 팁 이미지 시리즈를 분석하는데 사용될 수있다.

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em&gt; 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em&gt; 성장 콘

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

10.3K 조회수.  Boston College.  MATLAB 기반, 오픈 소스 소프트웨어 패키지, plusTipTracker은 미세 소관 역학 정량화 형광 - 표지 + 팁 이미지 시리즈를 분석하는데 사용될 수있다. 

비디오: Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

플라스틱 삽입 및 Xenopus laevis의 태아의 Sectioning

연구

생물학

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

The eggs of Xenopus laevis intact, lysed, and/or fractionated are useful for a wide variety of experiments. This protocol shows how to induce egg laying, collect and dejelly the eggs, and sort the eggs to remove any damaged eggs.

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Xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

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Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

에있는 동물 캡 이식 (ACT) 어세를 사용하여 조직 결정 Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

의 얼굴 이식<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 태아

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용

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Xenopus laevis 여성의 난자를 구하기

Xenopus laevis 에그의 작성과 분류는 압축을 풉니다

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

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의 얼굴 이식

의 해부

Xenopus의 번역 손상을 식별 할 수있는 모델로 laevis의