이 연구는 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 보조원 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (SD 지원), 국방부의 W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer 이명 연구 센터 (KMS) 등이 있습니다. Jessica E. Sagers, 원고에 대한 통찰력있는 의견에 감사드립니다.

연구 프로토콜은 매사추세츠의 눈과 귀의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다. 1. 절개 준비 <ol><li> 외과 테이블 준비하기 <ol><li> 수술 테이블을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오. </li><li> 현미경 옆에 두 개의 nonsterile prep pad를 놓습니다. </li><li> 가열 살균 된 작동 가위, 메스칼 핸들, 마이크로 나이프 및 포셉 (# 4 및 # 55 각각 2 개)을 포함하여 도구 트레이를 준비합니다. 악기 쟁반과 50mm의 깨끗한 벽으로 된 유리 바닥의 페트리 접시를 비 살균 패드 위에 놓습니다. </li><li> 살균 된 # 15 메스 블레이드를 얻습니다. 밀봉 가능한 비닐 봉지 또는 용기 (기관 지침에 따라 도체를 처리하는 것); 양동이에 얼음; 및 감기, 무균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS). 이 항목을다른 비 스테로이드 패드. </li><li> 50 ML 플라스틱 실험실 튜브에 HBSS를 전송하고 얼음에 넣어. </li></ol></li><li> 문화 준비 <ol><li> 모든 물질을 층류 후드에서 준비하십시오. 4 개의 시편마다 35mm 4-well petri dish의 4 개의 인레이에 4 개의 오토 클레이브 된 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 매 4 개의 시편에 대해 microcentrifuge tube에 다음과 같이 구성된 300 μL의 총 부피를 섞으십시오 : 조직 접착제 10 μL, NaHCO 3 285 μL 및 NaOH 5 μL. </li><li> 모든 커버 슬립에 결과 용액 45 μL를 넣고 RT에서 최소 20 분 동안 그대로 두십시오. 이 솔루션은 몇 시간 동안 coverslip에 남아있을 수 있지만 O / N을 남길 수 없습니다. </li><li> 오염에 대한 두 가지 장벽을 만들기 위해 하나 또는 두 개의 35mm 4 잘 배양 접시 (10) 페트리 접시 안에 놓습니다. </li><li> 98 % Dulbecco 수정 된 이글의 배지 (DMEM), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 ((마이크로) 원심 분리 튜브 내 웰 당 65μL)로 처리 하였다. 사용하기 전에 용액을 25 ° C로 예열하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 마우스 달팽이관 Explant의 해부 <ol><li> 신생아 마우스의 목을 베다. <ol><li> 60mm 플라스틱 페트리 접시를 얻고 뚜껑에 70 % 에탄올을 뿌려 표면이 젖도록하십시오. </li><li> 차가운 HBSS를 플라스틱 실험실 튜브에서 60mm 플라스틱의 바닥 부분과 50mm 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 붓는다. 절개하지 않을 때마다 조직을 차가운 상태로 유지하기 위해 플라스틱 실험실 튜브와 두 페트리 접시를 얼음에 보관하십시오. </li><li> P3 - P5 세 신생아 마우스를 라텍스 장갑의 절단 손가락에 얼음 위에 놓고 저체온증이 의식 상실을 유발할 때까지 기다립니다 (약 1-3 분). </li><li> 작동 가위로 마우스를 신속하게 처치하고 몸체를 밀봉 가능한 플라스틱 백에 폐기하십시오. 절단 된 신생아 머리를60mm 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 70 % 에탄올. </li></ol></li><li> 측두골의 거시적 절제술 <ol><li> 메스 블레이드를 사용하여 전방에서 후방 끝으로 (표면 봉합 바로 위에) 표면 절단을하여 두개골의 피부를 제거합니다. </li><li> 외이도를 메스 칼로 모두 자르고 피부를 앞쪽으로 접어서 전체 두개골을 드러내십시오. 참고 : 해부 현미경은 일반적으로이 단계에 필요하지 않지만 시각화를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> # 15 메스 블레이드를 사용하여 화살 봉합을 따라 두개골을 엽니 다. 달팽이관의 압축을 피하기 위해 칼날을 앞뒤로 부드럽게 움직여서 두개골을 자르십시오. 참고 : 두개골은이 나이에 골화되어서는 안되며 쉽게 절단해야합니다. </li><li> # 15 메스를 사용하여 궤도 바로 뒤쪽에서 수직으로 절단하여 주둥이를 제거하고 버립니다.잎. 참고 : 두개골의 후부에는 여전히 뇌와 달팽이가 있어야합니다. </li><li> # 4 포셉으로 무딘 절개를 통해 forebrain, 소뇌, 그리고 brainstem의 처분. </li></ol></li><li> 달팽이관의 현미경 적 추출 <ol><li> 범위 아래에 집게를 놓고 조명과 초점을 최적화하여 현미경 (배율 6.5X) 및 광원을 조정합니다. </li><li> 차가운 HBSS로 가득 찬 60mm 플라스틱 페트리 접시에 두개골의 두 반쪽을 놓습니다. </li><li> 주위의 stapedial artery (측두골 내의 구불 구불 한 동맥)에 인접한 것으로 확인되는 달팽이관 / e를 완전히 노출시키고 # 4 포셉을 사용하여 뼈를 일시적으로 뼈에서 분리합니다. </li><li> 달팽이관을 50mm의 유리 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 옮기고 접시를 현미경에 놓습니다. </li><li> 얼음에 두개의 다른 절반과 60mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. </li&gt; <li> vestibular 시스템에서 달팽이관을 제거하고 조심스럽게 # 4 포 셉와 달팽이관 (이 연령대의 연골) 캡슐을 해부. 모든 추가 단계에 # 55 포셉을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 조직 처리의 최종 단계 <ol><li> 조심스럽게 코티의 장기에 부착 된 나선형 인대와 마이크로 나이프 또는 2 개의 집게를 사용하여 modiolus를 분리하여 내이 조직을 가공합니다. <ol><li> 나선형 인대와 유모 세포 영역 사이의 틈새에있는 더 어둡고 반투명 한 부분을 잘라내어 가장 기초적인 부분을 잡고 부드럽게 풀어서 나선형 인대를 제거합니다. </li></ol></li><li> 표본을 배치하여 달팽이관의 길이 방향, 시상면을 얻은 다음 마이크로 나이프를 사용하여 달팽이관을 2 개에서 3 개 섹션으로 잘라 내고이 섹션을 꼭지점, (중간,) 및 basal turns. 페트리 접시에 수평으로 놓일 수있는 달팽이 explant 조각을 달성하기 위해 유모 세포와 신경 돌의 실제 레이어로 상사와 하체를 제거합니다. 참고 : 배양 접시에 안정적으로 접착하기에 적합한 크기는 달팽이관 회선의 약 절반입니다. </li><li> tortial 멤브레인, 코르티의 기관에 즉시 우수한 매우 얇은 반투명 레이어 제거, 부드럽게 포 셉와 멀리 벗겨. </li><li> Reissner의 멤브레인을 SGN 바로 위에 놓고 양쪽에 집게를 씌우고 벗겨냅니다. 참고 : 옆으로 위치한 손상된 헤어 셀 영역을 마이크로 나이프로 잘라서 제거하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 표본의 문화 플레이트로의 이전 <ol><li> 네 커버 슬립에서 조직 접착제 솔루션 45 μL를 제거합니다. 멸균 H 2 O 50 μL로 각 커버 슬립을 씻으십시오. 물을 기음. </li><li> 1 ML 피펫을 들어. 표본이 팁 내부에 달라 붙지 않도록 DMEM 약 120 μL로 피펫 팁을 적셔주십시오. </li><li> 1 ML 피펫을 사용하여 개별적으로 표본을 전송하십시오. HBSS로 채워진 작고 투명한 벽이있는 유리 바닥 페트리 접시에서 최대 70 μL를 피펫으로 추출한 다음 4 웰 배양 접시에있는 4 개의 인레이 (커버 슬립으로 준비) 중 하나에 시편을 액체와 함께 놓으십시오 . </li><li> 현미경 (배율 50 배)에서 시편의 방향이 올바른지 확인하십시오. tectorial 막이 제거 된 유모 세포의 영역이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. modilarus의 기본 부분과 함께 basilar 막이 아래쪽을 향하게하고 coverslip에 붙어 있는지 확인하십시오. <ol><li> 시험편을 거꾸로 뒤집어 놓은 경우 피펫 팁에 남아있는 HBSS를 인레이에 넣고 올바른 방향이 될 때까지 조각의 위치를 ​​변경합니다. 아니TE : 이것은 퇴화로 이어질 수있는 coverslip에서 구조적 지원없이 유모 세포가 문화 매체에 떠 다니는 것을 방지합니다. </li></ol></li><li> 1 ML 피펫을 사용하여 초과 HBSS를 대기음. 15 초를 기다리십시오. </li><li> 준비된 따뜻한 문화 매체 (98 % DMEM, 1 % N - 2, 1 % 암피실린) 60 μL를 표본에 직접 피펫. 피펫으로 시료를 만지지 않도록주의하십시오. 내부 및 외부 페트리 접시 커버를 교체하고 37 ° C에서 O / N 품어. </li><li> 스톡 용액을 모두 적당한 곳에 다시 채우고 시체와 잔여 폐기물을 처분하고 기관 지침 ( 예 : 에탄올이나 차아 염소산염을 사용)에 따라 수술 테이블을 오염 제거하고기구를 세척하고 고압으로 멸균 한 다음 적절한 용기에 날카로운 물건을 버리십시오 . </li></ol> 4. 최종 배양 배지 및 관심 대상 물질 추가 참고 : Cochlear explants는 10-16 시간 후에 사용할 준비가됩니다. <ol><li> 믹스 룸 준비하기97 % DMEM, 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 (마이크로 원심 분리 관에서 1 웰 당 65μL; 사용 전에 25 ℃로 가열). </li><li> 해당 치료 그룹의 솔루션에 관심있는 다른 물질을 추가하십시오. 형광 물질이 첨가 된 경우 ( 예 : 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 바이러스, 최근 발표에서는 50 μL에서 48 시간 동안 10 10 GC의 Adeno-Associated Virus (AAV) 농도가 사용됨) 18 , 빛. </li><li> 인큐베이터에서 달팽이 explant 포함 petri 접시를 전송하고 층류 후드 아래에 놓으십시오. </li><li> 인레이에서 피펫으로 오래된 문화 매체 (FBS 제외)를 대기음. </li><li> 준비된 따뜻한 문화 (치료) 매체 (97 % DMEM, 1 % FBS, 1 % N - 2, 1 % 암피실린 및 관심 물질)의 잘 당 60 μL를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터 (37 ° C)에 페트리 접시를 다시 놓습니다. </li><li> 보기 r악성 종양, 세포 이동 또는 달팽이 해부 체의 박리를 확인하고 최대 7 일 후에 염색을 수행하기 위해 현미경하에 egularly 수행합니다. </li></ol> 5. 면역 형광법 - 1 일째 <ol><li> 차단 용액 (94 % 인산 완충 식염수 (PBS), 5 % 정상 염소 또는 말 혈청 (2 차 항체에 따라 NGS / NHS), 1 % 비이 온성 계면 활성제 ( 표 2 참조) 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 각각의 항체와 함께 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)를 첨가 하였다. 참고 : 항체에는 1 : 400+ (myosin 7A, 내외부 유모 세포 용) 및 mouse anti-TuJ1 1 : 200+ (SGNs 용 β-tubulin) 또는 마우스 (IgG1) 항생제의 농도에서 토끼 항 -Myo7A (postsynapse density), postsynapse의 경우 postsynaptic density) 및 닭 항 -NF-H1 : 1000+ (neurofilament, anti-NF-H1 : SGN 및 신경 섬유의 경우). &quot;+&quot;means &quot;이상이어야합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 매체를 대기음. 시험편을 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> 층류 후드 아래, 멸균 PBS로 달팽이 explants 두 번 씻어 각 세탁 후 5 분 동안 표본을 쉐이커에 배치. </li><li> 쉐이커 (후드 아래)에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA -주의)에 조직을 고정시킵니다. PFA를 흡인하십시오. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 인공 호흡기를 준비된 차단 용액 (94 % PBS, 5 % NHS 및 1 % 비이 온성 계면 활성제)에 쉐이커에서 30 분간 놓습니다. </li><li> RT에서 카운터에 각각의 기본 항체 (사용하기 전에 소용돌이) O / N와 준비 주식 항체 솔루션 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비 이온 계면 활성제)에 달팽이 explants를 놓으십시오. 참고 : 젖은 종이 타월로 플라스틱 포장 (또는 추가 된 solut 경우 알루미늄 호일)로 묶인 페트리 접시를 포장하십시오이온은 GFP 발현 바이러스와 같은 형광 물질을 포함하고 있습니다)을 사용하여 접시를 습기있게 유지하고 항체 용액 O / N의 증발을 방지합니다. </li></ol> 6. 면역 형광법 - 2 일차 <ol><li> 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 얼룩 (300 nm)을 준비하고 단계 5.1에서 기본 항체에 보완 올바른 올바른 보조 항체 혼합물을 얻기 위해 재고 항체 솔루션을 사용합니다. ( 예 : 염소 항 토끼 488 1 : 200+ 및 염소 항 마우스 568 1 : 200+ 또는 염소 항 마우스 (IgG1) 568 1 : 1000+, 염소 항 마우스 (IgG2a) 488 1 : 500+, 및 염소 항 - 치킨 647 1 : 200+ 또는 Phalloidin 568 1 : 200+ (내외부 유모 세포 용)). </li><li> 일차 항체 용액을 대기음. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 인공 호흡기를 준비된 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)에 놓고카운터에 1.5 시간 동안 이차 항체 (사용 전 와류)를 가하고 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 2 차 항체 용액을 흡인하고 DAPI 얼룩 (1 분간 진탕 기 위에 놓은 후 흡인)로 달팽이 외식 편을 씻어냅니다. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 포 셉을 사용하여 4 - 웰 플레이트에서 표본과 coverslips를 제거하고, 증류수 H 2 O로 가득한받는 사람에 그들을 찍어, 그리고 종이 수건과 접촉하여 coverslips을 수직으로 가져 와서 건조. </li><li> 현미경 슬라이드에 삽입 방지 매체 한 방울을 놓고 커버 슬립을 거꾸로 뒤집어서 매체에 묻힌 조직을 담그십시오. </li><li> 유리 아래에 시편을 분쇄하지 않고 가장자리를 원주 방향으로 덮는 깨끗한 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 봉인합니다. 슬라이드를 15 ~ 20 분 동안 빛이 닿지 않는 곳에 덮고 평평하게 놓고 건조한 상태로 놓습니다.상자에 넣거나 공 촛점 현미경으로 검사하십시오. 참고 : 형광 염색은 슬라이드를 4 ° C 또는 -20 ° C에 보관하여 보존하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol> 7. 공 촛점 이미징 <ol><li> 신경 돌기와 SGN을 포함하여 Corti 지역의 기관에 대한 개요와 확대 된 그림을 얻습니다. 참고 : 이미징 프로세스의 표준 설정 : 1,024 x 1,024 픽셀, 400 Hz의 속도, 프레임 평균 3, 전체 레이저 강도 20 %, 오일 침지 (일반적으로 2 배 디지털 줌과 결합 된) 20X 및 63X 렌즈의 형식. DAPI, Myo7A 및 TuJ1 염색 프로토콜에 대한 채널 설정은 위에 요약되어 있습니다. 405 5 % DAPI, &quot;Smart Gain&quot;766.8V, &quot;Smart Offset&quot;0.0 % - 488 15 % FITC (fluorescein isothiocyanate), &quot;Smart Gain&quot;622.2V , &quot;스마트 오프셋&quot;0.0 % - 561 13 % 테트라 메틸로 마틴 이소 티오 시아 네이트 (TRITC), &quot;스마트 게인&quot;562.4V, &quot;스마트 오프셋&quot;0.0 %. </li><li> 이미지를 z 스택에 병합하려면소프트웨어를 사용하여 z 축 투영을 얻습니다. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons.">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li><li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration:+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy.">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li><li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+after+noise+exposure:+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+&amp;#34;recovered&amp;#34;+ears.">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &amp;#34;recovered&amp;#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li><li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea.">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li><li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector.">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li><li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes.">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li><li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear.">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

연구원은 달팽이관 외식에 관련된 실험을하기 전에 해부 기술을 완벽하게해야합니다. 유모 세포는 일반적으로 학습 곡선에서 초기에 수행되는 해부 중에 손상되며, 완전 무결 한 특히 문제가되는 순간은 안정적인 손, 적절한 도구 및 경험이 필요한 tectorial membrane의 제거입니다. 시간과 자원을 절약하기 위해 해부 현미경으로 시각 제어를 수행해야하며 잠재적으로 손상된 부위를 기록해야합니다....

Sensorineural Hearing Loss (SNHL)은 내이 또는 오름차순 청각 경로의 손상을 나타냅니다. 청력 상실은 인간 1 에서 가장 흔한 감각 결손이지만 치유 요법은 아직 존재하지 않습니다 2 . 인공 와우 또는 청각의 뇌간 이식 물이 심한 SNHL 환자의 청력을 어느 정도 회복시킬 수는 있지만, 이러한 장치가 제공하는 청력은 특히 자연스러운 청력과는 매우 다르며 특히 소음의 말을 이해하거나 음악을 듣는 동안 매우 다릅니다. 유모 세포 변성은 오랫동안 외상성 청각 사건 ( 예 : 시끄러운 소음에 노출)의 주요 결과로 간주되어 왔지만, 유모 세포에서 청각 신경으로 정보를 전송하는 시냅스가 적어도 음향 외상에 취약한 증거가 증가하고 있습니다 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . 청각 기능 평가를위한 현재의 금 표준 인 인간의 청력 역치는 내이의 특정 세포 손상을 예측하지 않기 때문에 가능한 한 빨리 세포 변성을 감지하고 적절한 치료를 시작하기 위해보다 정교한 도구가 필요합니다. 청력 상실에 대한 유망한 약제 처리법 은 시험 관내 에서 균질 세포 배양 물 에서 종종 시험되지만, 그러한 시스템은 달팽이 미세 환경을 정확하게 모델링하지 않습니다. Cochlear 세포는 Corti 10 , 11 또는 Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 의 기관을 분리하여 또는 배양 할 때 손실되는 중요한 생체 내 과정 인 달팽이관 8,9 에서 다른 세포 유형에 영향을주는 영양 요소를 분비하는 것으로 알려져 있습니다 분자 마커를 분석그러나 &quot;정밀 의학&quot;을 추구하기 위해 생체 외 데이터를 검증하여 청력 상실에 대한 새로운 개인 맞춤 치료법을 확립하는 데 필요한 생체 내 연구는 상당한 자원과 시간을 필요로합니다. 이는 특히 고려할 때 적합합니다 청력 검사와 이어지는 인공 와우의 절개를 통해 중이 중이거나 둥근 창 막 주입을 완벽하게 수행하고 수행하는 데 얼마나 많은 노력이 필요한가 인공 와우로 알려진 체외의 체외 배양에서 유망한 화합물을 효율적으로 스크리닝하는 것은 경제적이며 신뢰할 수있는 대안을 제공합니다 14 , 15 , 16 , 17 . 이 기사에서는 치료 된 달팽이 외식편을 생성, 유지 및 평가하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 모델의 특정 응용 프로그램은 심사에서의 사용을 포함하여 강조됩니다.유전자 치료를위한 바이러스 성 벡터의 비교 평가를 포함한다. ex vivo explant approach는 연구자들이 주어진 세포 치료법 이 다른 세포 집단 에 미치는 영향을 그 자리 에서 가시화 할 수있게하여 세포 유형별 메커니즘의 확인과 그 이후의 목표 화 된 치료법의 정제를 용이하게한다. 전반적으로,이 기술은 달팽이관 내 에서 공존하는 매우 다른 세포 유형 사이의 중요한 혼선을 보존하면서 생체 내 에서 달팽이관을 연구 할 수있는 모델을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A antibody, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H antibody, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)</td><td>Antibodies Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>anti-TuJ1 antibody, mouse</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Clear Nail Polish</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO&amp;reg;, Sleeve/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>260368</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&amp;nbsp;</td><td>Aliquot in 50 mL tubes and store in -20&amp;deg;C freezer</td></tr><tr><td>goat anti-chicken-647 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit-488 secondary antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Instrument Tray with Lid Stainless Steel</td><td>Mountainside Medical</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>Micro (dissecting) knife &amp;ndash; angled 30&amp;deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1&quot;), 1 mm thick, white, pack of 72</td><td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X), 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating scissors</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&amp;nbsp;</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Phalloidin, Alexa Fluor 568&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>Prep Pad, Non Sterile&amp;nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave prior to use</td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C Stereo Microscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (non-ionic surfactant)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield antifade mounting medium for fluorescence</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6&#039;&#039; - 2 mm thick</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research

지난 수십 년 동안 청력 연구가 눈에 띄게 발전했지만, 내이의 민감한 mechanosensory 구조를 손상 시키거나 손상시키는 감각 신경성 청력 손실 (SNHL)에 대한 치료법은 아직 없습니다. 정교한 in vitro 및 ex vivo 분석법이 최근 수년간 출현하여 SNHL 치료법 개발을위한 자원을 최소화하고 치료 노력을 가속화하면서 잠재적으로 치료 화합물의 증가를 시험 할 수있게되었습니다. 특정 세포 유형의 균질 배양이 현재의 연구에서 중요한 역할을 계속하고 있지만, 많은 과학자들은 이제 달팽이 외식 편으로 알려진보다 복잡한 기관 내 배양에 의존합니다. 내이에서 조직화 된 세포 구조를 보존하면 내외부 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런, 신경 세포를 포함한 달팽이관 인프라의 다양한 구성 요소를 현장에서 평가할 수 있습니다.ites 및 지원 세포. 여기에서는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining을 제시합니다. 이러한 explants의주의 깊은 준비는 SNHL에 기여하는 메커니즘의 식별을 용이하게하고 청각 연구 커뮤니티를위한 중요한 도구를 구성합니다.

많은 프로토콜이 Corti 체외 이식편의 기관에 초점을 맞추고 있지만이 기술은 SGNs를 포함하여 전체 달팽이관의 해부학 구조를 보존하려고 시도합니다. 이것은 연구자들에게 Corti 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경 돌기 및 somata에 대한 주어진 치료의 효과를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 설명 된 것처럼 모 틸리 움의 일부를 보존하는 절개를 수행하는 것은 Corti만의 ...

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

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Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

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17.5K 조회수.  Massachusetts Eye and Ear.  이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Making Sense of Listening: The IMAP Test Battery

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the abilities to extract and use the information encoded in the auditory signal. We refer to these as listening skills (or auditory processing AP). Deficits in these skills are associated with delayed language and literacy development, though the nature of the relevant deficits and their causal connection with these delays is hotly debated.
When a child is referred to a health professional with normal hearing and unexplained difficulties in listening, or associated delays in language or literacy development, they should ideally be assessed with a combination of psychoacoustic (AP) tests, suitable for children and for use in a clinic, together with cognitive tests to measure attention, working memory, IQ, and language skills. Such a detailed examination needs to be relatively short and within the technical capability of any suitably qualified professional. Current tests for the presence of AP deficits tend to be poorly constructed and inadequately validated within the normal population. They have little or no reference to the presenting symptoms of the child, and typically include a linguistic component. Poor performance may thus reflect problems with language rather than with AP. To assist in the assessment of children with listening difficulties, pediatric audiologists need a single, standardized child-appropriate test battery based on the use of language-free stimuli.
We present the IMAP test battery which was developed at the MRC Institute of Hearing Research to supplement tests currently used to investigate cases of suspected AP deficits. IMAP assesses a range of relevant auditory and cognitive skills and takes about one hour to complete. It has been standardized in 1500 normally-hearing children from across the UK, aged 6-11 years. Since its development, it has been successfully used in a number of large scale studies both in the UK and the USA. IMAP provides measures for separating out sensory from cognitive contributions to hearing. It further limits confounds due to procedural effects by presenting tests in a child-friendly game-format. Stimulus-generation, management of test protocols and control of test presentation is mediated by the IHR-STAR software platform. This provides a standardized methodology for a range of applications and ensures replicable procedures across testers. IHR-STAR provides a flexible, user-programmable environment that currently has additional applications for hearing screening, mapping cochlear implant electrodes, and academic research or teaching.

A test battery (IMAP) for performing an in-depth assessment of auditory and cognitive abilities contributing to listening skills is described. It is quick to administer, child-friendly and free from linguistic confounds. Stimulus generation and protocol management are controlled via a software platform (IHR-STAR) to ensure replicable procedures.

IMAP 테스트 배터리 : 듣기의 감각을 만들기

The ability to hear is only the first step towards making sense of the range of information contained in an auditory signal. Of equal importance are the ...

의학

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

같은 자폐증과 정신 분열증과 같은 일반적인 장애에 드 노보 변이를 식별하는 전략

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

생물학

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building the highly ordered, complex structure of the mammalian cochlea proceeds for around ten days. In order to study changes in gene expression over this period and their response to pharmaceutical or genetic manipulation, long-term imaging is necessary. Previously, live imaging has typically been limited by the viability of explanted tissue in a humidified chamber atop a standard microscope. Difficulty in maintaining optimal conditions for culture growth with regard to humidity and temperature has placed limits on the length of imaging experiments. A microscope integrated into a modified tissue culture incubator provides an excellent environment for long term-live imaging. In this method we demonstrate how to establish embryonic mouse cochlear explants and how to use an incubator microscope to conduct time lapse imaging using both bright field and fluorescent microscopy to examine the behavior of a typical embryonic day (E) 13 cochlear explant and Sox2, a marker of the prosensory cells of the cochlea, over 5 days.

Live imaging of the embryonic mammalian cochlea is challenging because the developmental processes at hand operate on a temporal gradient over ten days. Here we present a method for culturing and then imaging embryonic cochlear explant tissue taken from a fluorescent reporter mouse over five days.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

신경과학

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

쥐 달팽이관 유모 세포의 효율적인 In vitro 배양

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

저자 스포트라이트: 청각 연구를 위한 쥐 유모 세포 배양의 발전 

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로

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