우리는 그의 도움이 의견 및 제안에 대 한 제이콥 재를 감사합니다. 우리는 또한 생물 정보학 분석에 그의 도움에 대 한 앤 데 종 감사합니다. Yanglei 이순신 Zhibo Li 중국 장학금 위원회 (CSC)에 의해 지원 됩니다. 우리 감사 NWO TTW Perspectief 전문 직원 Back2Roots (TKI-AF-15510) OPK에 그들의 재정 지원에 대 한.

1. 출 감자 멸 균된 조건에서
<ol><li>감자 표면 살 균 물으로 린스. 그리고 5 분 동안 3% 염소에 70% 에탄올에 감자를 목욕. 다시 모든 나머지 염소 제거 살 균 물으로 린스.</li>
	<li>출 아 하 고 감자 괴 경; 성장에 필요한 자료를 준비 플라스틱 냄비, engraftment 바구니, 질 석, 소독 하 고 20 분 동안 121 ° C에서 그들 압력가 마로 소독 하 여 물. 참고: 사용 되는 모든 재료 멸 인지 확인 합니다. 그렇지 않으면, 다른 살 균 방법을 사용 합니다.</li>
	<li>표면 살 균 된 감자를 engraftment 바구니에 넣고 젖은 질 석 포함 하는 압력가 마로 소독 냄비에 배치.</li>
	<li>3 주 동안 24 ° C에서 기후 챔버에 냄비 유지. 빛 (120 µmol m-2의-1)와 어둠의 8 h 16 h의 사이클에 그것을 설정 합니다. 미생물 오염을 방지 하려면 냄비를 커버 하는 대형 유리 섬유 상자를 사용 합니다.</li>
</ol>2. 감자 루트 Exudates 수집
<ol><li>새싹 새싹, 전송 압력가 이온된 물 150 mL 소독된 비 커에 전체 감자 바구니 가득 때 감자와 함께 물 표면과 뿌리 바로 위에 배치 tubers는 물에 잠긴 ( 그림 1참조). 기후 챔버에는 종묘를 유지 하 고 동일한 설정을 사용 하기 전에 [24 ° C, 16 h 빛 (120 µmol m-2의-1), 8h 어둠의의].</li>
	<li>두 번째 날부터 exudates를 포함 하는 물을 수집 하 고 살 균 이온을 제거 된 물으로 비 커를 리필. 샘플링을 수행 매일 묘 종 전송 후 7 일까지.</li>
	<li>4 ° c.에서 별도로 각 샘플 저장 각 샘플에 대 한 확산에 Luria Bertani 100 µ L (파운드, 1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 0.5 %NaCl) 천 배지 미생물 오염에 대 한 확인. 오염 된 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>1 종묘의 수집 된 샘플을 결합 하 고-40 ° C ~ 150 mL의 최종 볼륨에서 그들을 freeze-drying에 의해 그들을 집중.</li>
</ol>3. 성장 하는 박테리아
<ol><li>B. mycoides 스트레인 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C 글리세롤 재고에서 행진 하 고 하룻밤 30 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>접시에서 단일 식민지와 파운드 액체 매체를 접종 하 고 하룻밤 30 ° c.에서 200 rpm에서 떨고 인큐베이터에서 문화를 성장</li>
</ol>4. 치료 및 박테리아의 샘플링
<ol><li>루트 exudates 부정적인 제어를 치료 하는 박테리아의 성장 곡선 비교를 파운드 액체 매체의 50 mL를 포함 하는 플라스 크의 시리즈를 준비 합니다. 모든 플라스 크에 하룻밤 세균성 문화의 0.5 mL을 추가 하 고 중간, 0%, 5%, 10% 또는 15% (v/v) 루트 exudate 또는 살 균 이온된 수를 각각 추가.</li>
	<li>루트 exudates 대신 이온 물 문화를 사용 하 여 컨트롤. 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600) 마다 1 시간 이후에. 시간 대 세600 값을 그려서 성장 곡선을 생성 합니다. 참고: 우리는 루트 exudates의 10% B. mycoides 의 성장에는 영향을 미치지 않았다 보았다 ( 그림 2참조). 이 비율은 RNA-seq 실험을 위해 사용 되었다.</li>
	<li>희석의 초기 세600 미리 따뜻하게 파운드 매체의 90 mL와 함께 하룻밤 B. mycoides 문화 ~ 300 mL 플라스 크에 0.05. 문화에 루트 exudates의 10 mL를 추가 하 고 1 시간에 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>10 mL 살 균 이온된 수 치료를 사용 하 여 컨트롤. 4 ° c.에 2 분 동안 9000 x g에서 원심 분리 하 여 문화에서 세포를 수집 상쾌한, 삭제 즉시 액체 질소에는 펠 릿을 동결 다음 사용까지-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.</li>
</ol>5. RNA 격리
참고: 시작 하기 전에 격리, 작업 대, 선반, 및 펫 정리 하 여 준비 그들 RNase 오염 제거 솔루션 ( 재료의 표참조). 모든 시간에 장갑을 착용 하 고 모든 튜브, 팁 및 솔루션은 RNase 무료 다는 것을 확인 한다. 가능 하면 얼음에 샘플 항상 유지.
<ol><li>초순 수 (100 µ L DEPC의 100 mL 해결책 당)에 diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 0.1% (v/v)을 추가 하 고 잘 섞어 하룻밤 실 온에서 보관. 압력솥 혼합물 하룻밤 치료 후는 DEPC를 비활성화. 이 DEPC 처리 초순 준비 테 버퍼를 사용 하 여 [10 mM Tris HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] 10 %SDS (w/v) 솔루션.</li>
	<li>얼음에 셀 펠 릿을 녹여 고 테 (DEPC) 버퍼의 400 µ L에서 각각 일시 중단. 2 mL 스크류 캡 튜브에 정지를 전송 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 서 서 혼합물을 허용 그리고 섞은 300 µ L의 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1 v/v) 및 (산 페 놀, RNA 등급), 페 놀의 300 µ L Resuspended 셀에 추가 하려면 유기 상위 단계의 500 µ L를 가져가 라. 튜브에 10 %SDS와 유리 구슬 (0.5 µ m)의 0.5 g 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>모자를 단단히 닫고 비드 밀 균질 화기에 튜브를 배치 ( 재료의 표참조). 얼음에 1 분 간격으로 3 × 45의 펄스 균질 화를 수행 합니다.</li>
	<li>샘플 11000 x g (4 ° C)에서 10 분 원심 하 고 새 튜브를 위 단계를 전송.</li>
	<li>5.5 단계에서 상위 단계로 클로 프롬 isoamyl 알콜 (24:1)의 500 µ L을 추가 하 고 11000 x g (4 ° C)에서 5 분을 위한 혼합물을 원심. 참고: 다음 단계는 상업적인 유리 섬유 필터 기반 RNA 격리의 제조 업체의 지시에서 수정 된 키트 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>신선한 튜브를 상위 단계의 500 µ L을 전송 세포/바인딩 버퍼의 2 권 (1 mL)을 추가 하 고 아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>(에서 RNA 격리 kit) 필터 및 컬렉션 튜브를 결합 하 고 필터 튜브를 단계 5.7에서에서 혼합물을 플라스틱. 원심 튜브 15 g와 흐름을 통해 삭제 x 8000에서 s.</li>
	<li>100 µ L DNase 버퍼, DNase의 10 µ L의 microcentrifuge 튜브 1.5 mL를 준비, 그리고 5 µ L의 RNase 억제제 ( 재료의 표참조). 필터 튜브의 필터에 준비 솔루션 믹스를 추가 하 고 15-25 ° c.에 20-30 분 동안 품 어</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 세척 단계를 수행 합니다. 차입 버퍼의 50 µ L를 사용 하 여 RNA elute.</li>
	<li>-80 ° C에서 eluted RNA를 저장 하 고 그것의 주위에 플라스틱 파라핀 영화를 넣어. 동시에 품질 검사를 수행 하는 1.5 mL microcentrifuge 튜브 샘플의 약간 microliters 전송.</li>
</ol>6. RNA 품질 확인 및 시퀀싱
<ol><li>Microvolume 분 광 광도 계와 RNA를 확인 하십시오. 참고: 260/280에서 흡 광도 비율 1.8 이상 이어야 합니다 그리고 비율 260/230에서 적어도 1.8, 2.0 이상 선호 이상 이어야 합니다.</li>
	<li>실행 권장 RNA 분석을 사용 하 여 자동화 된 전기 이동 법 악기에서 정화 RNA 키트 ( 재료의 표참조); RNA 무결성 번호 (린) 진행 7 위 이상 이어야 합니다.</li>
	<li>샘플 당 RNA의 3 µ g의 총 금액을 사용 하 여 RNA-Seq 라이브러리 준비 라이브러리 생성 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 권장 사항에 따라. 참고: 라이브러리 준비는 높은 처리량 시퀀싱 플랫폼에서 시퀀싱 했다 고 쌍 간 읽기 생성 했다.</li>
</ol>7. 데이터 분석 웹 기반 파이프라인 T-렉스를 사용 하 여
<ol><li>버전 0.0.13 FASTX-도구 키트를 사용 하 여 필터링 품질 (> 20 Phred 품질 평가 점수). Trimmomatic 도구 어댑터 시퀀스에서 원시 RNA-Seq 읽기 트림. 참고: 모든 다운스트림 분석은 고품질을 가진 깨끗 한 데이터에 근거 했다.</li>
	<li>B. mycoides ATCC 6462 NCBI 게놈 데이터베이스 다운로드 (NCBI 승인 번호: CP009692.1) 및 Bowtie2/2.2.3를 사용 하 여 깨끗 한 읽기를 매핑하기 위한 참조 게놈으로 그것을 사용.</li>
	<li>읽기 숫자 계산을 사용 하 여 HTSeq v0.6.1 각 유전자에 매핑되고 각 유전자의 백만 매핑된 읽기 (RPKM) 당 대 본의 kilobase 당 읽기가이 유전자에 매핑된 유전자와 읽기의 길이에 따라.</li>
	<li>T-렉스 파이프라인에 의해 데이터의 분석을 위해 입력, 뿐만 아니라 3 개의 설명 파일 RPKM 테이블 사용: (i) (ii) 어떤 요소가 차동 유전자 발현에 대 한 비교를 정의 하기 위해 대조 파일 요인에 실험을 설명 하기 위해 요인 파일 그리고 (iii) 관심사의 유전자의 그룹을 설명 하는 클래스 파일. 참고: 설명 파일은 in.txt 형식입니다. 예는 T-렉스 (http://genome2d.molgenrug.nl/)의 웹 페이지에서 찾을 수 있습니다. T-렉스를 사용 하 여 데이터 분석에 대 한 자세한 지침 드 종 외. 여 이전 간행물에서 찾을 수 있습니다. 14.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Haichar, F. e. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+host+habitat+and+root+exudates+shape+soil+bacterial+community+structure.">Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure.</a> The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).</li><li>Badri, D. V., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+function+of+root+exudates.">Regulation and function of root exudates.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32 (6), 666-681 (2009).</li><li>Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+exudation:+the+ecological+driver+of+hydrocarbon+rhizoremediation.">Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation.</a> Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).</li><li>Mark, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+of+bacterial+responses+to+root+exudates+identifies+genes+involved+in+microbe-plant+interactions.">Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).</li><li>Fan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+profiling+of+Bacillus+amyloliquefaciens+FZB42+in+response+to+maize+root+exudates.">Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates.</a> BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).</li><li>Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corn+(Zea+mays+L.)+root+exudates+and+their+impact+on+14C-pyrene+mineralization.">Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization.</a> Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).</li><li>Lambert, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clover+root+exudate+produces+male-biased+sex+ratios+and+accelerates+male+metamorphic+timing+in+wood+frogs.">Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs.</a> Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).</li><li>Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+organic+acid+exudates+and+properties+of+rhizosphere+soils+of+white+spruce+(Picea+glauca)+and+subalpine+fir+(Abies+lasiocarpa).">Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa).</a> Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).</li><li>Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizosphere+carbon+flow+in+trees,+in+comparison+with+annual+plants:+the+importance+of+root+exudation+and+its+impact+on+microbial+activity+and+nutrient+availability.">Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability.</a> Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).</li><li>Rovira, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+root+exudates.">Plant root exudates.</a> Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).</li><li>Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+systemic+resistance+in+sugar+beet+elicited+by+a+non-pathogenic,+phyllosphere-colonizing+Bacillus+mycoides,+biological+control+agent.">Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).</li><li>Peng, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+cucumber+Pythium+damping-off+pathogen+with+zoosporicidal+biosurfactants+produced+by+Bacillus+mycoides.">Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides.</a> Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).</li><li>Ambrosini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diazotrophic+bacilli+isolated+from+the+sunflower+rhizosphere+and+the+potential+of+Bacillus+mycoides+B38V+as+biofertiliser.">Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser.</a> Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).</li><li>de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-REx:+transcriptome+analysis+webserver+for+RNA-seq+expression+data.">T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data.</a> BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).</li><li>Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+transcriptomics+of+Bacillus+mycoides+strains+in+response+to+potato-root+exudates+reveals+different+genetic+adaptation+of+endophytic+and+soil+isolates.">Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).</li><li>Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNASwift:+a+rapid,+versatile+RNA+extraction+method+free+from+phenol+and+chloroform.">RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform.</a> Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).</li><li>Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-samtools:+Ruby+bindings+for+SAMtools,+a+library+for+accessing+BAM+files+containing+high-throughput+sequence+alignments.">Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments.</a> Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+the+Swiss-army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).</li><li>Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGS-trex:+next+generation+sequencing+transcriptome+profile+explorer.">NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer.</a> BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

식물-미생물 상호작용 박테리아와 식물 사이 가늘게 조정된 평형에 의해 결정 될 가설 되어 있다. 이러한 상호 작용은 매우 복잡 하 고 공부 하기 어려운 자연 시스템에는 구성 다양 한 미생물 종, 잠재적으로 컨소시엄의 역할. 이 문서는 잘 제어 된 조건 하에서 루트 exudates에 세균성 응답을 공부 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. Rhizobacteria, 루트 exudates에 노출 시의 transcriptome 프로필 rhizosphere ...

식물 exudate rhizosphere1, 즉, 뿌리 근처 토양의 좁은 영역에 뿌리를 통해 광합성 동안 고정 탄소의 최대 20% 수 있습니다. 더 높은 영양소 여부는 rhizosphere은 식물 성장을 승진 시키는 박테리아를 포함 하 여 다양 한 미생물에 대 한 적당 한 서식 지. 루트 exudates 이온, 무기 산, 산소, 물 같은 무기 화합물의 범위를 포함합니다. 그러나, 대부분의 루트 exudates 화합물 저 분자 무게 화합물 및 고분자 중량으로 분할 될 수 있다 유기 물질에 의해 형성 된다. 저 분자 무게 화합물 아미노산, 유기 산, 설탕, 페 놀 화합물, 지방산 및 2 차 대사 산물의 배열을 포함합니다. 점액과 단백질2,3높은 분자 무게 화합물에 의하여 이루어져 있다. Rhizosphere 미생물 에너지 원으로 성장 및 개발에 대 한 이러한 화합물 중 일부를 사용할 수 있습니다. 루트 exudates 이후는 exudates에서 공장 생산 화합물 영향을 미칠 수 rhizosphere 관련 된 박테리아의 동작에 영향을 주는 특정 유전자의 표현에 의해 rhizobacterial 커뮤니티 형성에 중요 한 역할을.
루트 exudates에 세균성 응답을 이해 해독 식물-미생물 상호작용 메커니즘에서 중요 한 단계입니다. 식물-미생물 상호작용에 세균성 응답 차동 유전자 발현의 제품으로, transcriptome 분석에 의해 공부 될 수 있다. 이 메서드를 사용 하 여 이전 연구 식물-미생물 상호작용에 관련 된 몇 가지 중요 한 유전자를 확인. 녹 농 균, 신진 대사, chemotaxis, 유형 II 분 비에 관여 하는 유전자 사탕 루트 exudates4에 응답을 표시 했다. 팬 외. 5 옥수수 루트 exudates 응답에 B. amyloliquefaciens FZB42의 프로 파일링 transcriptomic 공부. 그들의 결과, 강하게 루트 exudates에 의해 유도 된 유전자의 몇몇 그룹에에서 관련 영양소 사용률, chemotaxis, 운동 성, 및 항균 성 펩 티 드와 polyketides의 비 ribosomal 합성 대사 경로 보여 줍니다.
이러한 연구의 정확도 루트 exudates 컬렉션에 의존합니다. 여러 가지 방법을 서로 다른 목적을 위해 루트 exudates의 컬렉션을 설명 했으며, 비록 그들은 정교한 악기를 요구 하거나 잘 제어 조건6,,78수행 되지 않습니다. 또한, rhizosphere 억제 미생물 수 영향 루트 exudate 구성 식물 세포 막 침투성에 영향을 미치는 미생물9의 컨소시엄의 경우 특히 루트 조직 손상. 루트 exudates에 미생물 반응 조사, 다른 미생물10화합물의 피하기 위하여 잘 정의 된 조건을 사용 하 여 중요 하다. 또한, 높은-품질 RNA가 RNA-seq transcriptome 연구 기반을 위한 필요 합니다. 그러나, 비 모델 세균성 긴장 처리, 표준 프로토콜 또는 상업 키트 보통 있다 알 수 없는 요인 또는 특별 한 성장 특성으로 인해 낮은 효율성.
여기에 설명 된 프로토콜 사용 하 여 B. mycoidesFirmicute 문의 그람 양성, 포자 형성 박테리아를 확인 했습니다. 그것은 다양 한 식물 종의 rhizosphere에 유비 쿼터 스입니다. 여러 식물 성장 촉진 특성 사탕11, 감쇠 떨어져 병원 체의 Pythium 질소로 서 오이12, 억제에에서 체계적인 저항 (ISR)의 유도 포함 한이 종에 대 한 보고 해바라기 rhizosphere13에 고정입니다. 그러나, 호스트 플랜트와의 상호 작용의 분자 메커니즘은 잘 공부 하지.
여기에 제시 된 실험의 목적은 감자 루트 exudates에 endosphere 절연 B. mycoides 의 transcriptomic 반응을 것입니다. 즉, 프로토콜은 다음 단계로 구성 됩니다: 첫째, 메 마른 조건 하에서 감자 루트 exudates 수집. 그런 다음, 루트 exudates 치료 세균 세포에서 높은-품질 RNA를 추출 합니다. 마지막 단계는 T-렉스 웹 기반 파이프라인14를 사용 하 여 데이터 분석. 이 프로토콜 루트 exudates와 접촉 시 식 수준에 변화를 표시 하 고 따라서 식물-미생물 상호작용에 중요 한 역할을 재생 있습니다 B. mycoides 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="987">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">sodium hypochlorite</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">&#160;CAS: 7681-52-9&#160;</td>
			<td style="width:339px;">10-15%&#160; active chlorine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">incubater</td>
			<td style="width:236px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Innova 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Genesys 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">liquid nitrogen</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">glass beads</td>
			<td style="width:236px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">G8893</td>
			<td>0.5 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">2.0 ml tube with screw cap</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNase free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bead mill homogenizer</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td style="width:152px;">607</td>
			<td>Mini_beadbeater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">centrifuge</td>
			<td style="width:236px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:152px;">5430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 1609-47-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td style="width:236px;">sigma</td>
			<td style="width:152px;">CAS: 151-21-3&#160;</td>
			<td>10% solution prepared with DEPC treated MQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">TE buffer</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>RNA grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">chloroform-isoamyl alcohol&#160;</td>
			<td style="width:236px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td>prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">High pure RNA isolation kit</td>
			<td style="width:236px;">Roche</td>
			<td style="width:152px;">11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase Decontamination Solution</td>
			<td style="width:236px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">AM9780</td>
			<td>RNase-Zap</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Automated electrophoresis instrument</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">2100</td>
			<td>Bioanalyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microvolume spectrophotometer</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">Nanodrop ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNA quality analysis kit</td>
			<td style="width:236px;">Agilent</td>
			<td style="width:152px;">RNA 6000 Nano kit&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">RNase inhibitor</td>
			<td style="width:236px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:152px;">RiboLock</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:260px;">Directional RNA library Prep kit</td>
			<td style="width:236px;">NEB</td>
			<td style="width:152px;">Ultra</td>
			<td style="width:339px;">For Illumina</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plant-microbe interaction: transcriptional response of bacillus mycoides to potato root exudates

유익한 식물 관련 박테리아 성장을 촉진 하 고 식물에 질병을 방지에 중요 한 역할. Biofertilizers 또는 biocontrol 대리인으로 식물 성장을 승진 시키는 rhizobacteria (PGPR)의 응용 프로그램 기존의 비료의 사용에 효과적인 대안이 되 고 저렴 한 비용에 작물 생산성을 높일 수 있습니다. 식물-미생물 상호작용 호스트 공장 분 비 신호 및 그들의 관련 된 박테리아에 의해 hereon 반응에 의존. 그러나 어떻게 유익한 박테리아의 분자 메커니즘 응답 그들의 관련 된 식물 유래 신호는 완전히 이해 되지 않습니다. 루트 exudates 박테리아의 transcriptomic 반응 평가 세균성 유전자 발현 rhizospheric 조건 하에서 규제를 결정 하는 강력한 접근 이다. 이러한 정보는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 근본적인 메커니즘을 이해 하는 데 필요한 있습니다. 이 종이 transcriptomic 반응을 B. mycoides EC18, 감자 루트 exudates 감자 endosphere에서 격리 하는 긴장의 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 최근 높은 처리량 시퀀싱 기술의 도움으로,이 프로토콜은 몇 주 및 생산 대규모 데이터 집합에서 수행할 수 있습니다. 먼저, 루트 exudates B. mycoides 문화에 추가 되는 무 균 조건 하에서 수집 합니다. 이러한 문화에서 RNA는 상용 키트와 결합 하 고 자동화 된 전기 악기에 의해 품질 관리 대상이 페 놀/클로 프롬 방법을 사용 하 여 격리 됩니다. 시퀀싱, 데이터 분석 수행 됩니다 웹 기반 T-렉스 파이프라인 차동 표현한 유전자의 그룹을 식별 하는 후에. 이 방법은 세균 유전자 식물-미생물 상호작용에 관련 된 새로운 발견을 촉진 하는 유용한 도구입니다.

식물 관련 미생물 긍정적으로 식물의 성장과 건강에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 식물과 그들의 미생물 symbionts 사이 복잡 한 상호 작용의 메커니즘 완전히 이해 되지 않는다. 루트 exudates rhizobacterial 활동 및 행동 조절에 중요 한 역할 그리고 그것은 일반적으로 가정 하는 뿌리의 미생물 식민지 루트 exudates 미생물의 매력으로 시작. 이 작품의 목표에 감자 루트 exudates ...

Watch this Scientific Journal Video about Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates at JoVE.com

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

감자 루트 Exudates 균 Mycoides 의 Transcriptional 응답을 식물 세균 상호 작용:

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

plant-microbe-interaction-transcriptional-response-bacillus-mycoides

Research

JoVE Journal

Biology

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

12.4K 조회수.  University of Groningen. 여기에 제시 된 프로토콜의 목표 endosphere 절연 균 mycoides 의 감자 루트 exudates에 transcriptomic 반응을 것입니다. 이 메서드는 식물-미생물 상호작용에 관련 된 중요 한 세균 유전자의 식별을 용이 하 게 하 고 원칙적으로 다른 endophytes 및 식물, 사소한 조정에 적용.

비디오: Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

연구

생물학

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

이미징 불일치 복구 및 DNA의 손상 세포 응답 바실러스 subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

애기 장대 루트 Gravitropic 응답의 고해상도 시간 경과 이미지를 수집하는 평판 스캐너를 사용하여

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

감자와 니코티아나 벤타미안의 농아침투 및 PVX 농병감염

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

의 수집과 분석<em&gt; 애기 장대</em&gt; 사부는 EDTA-촉진 방법을 사용하여 삼출물

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

방법은 쥐 Bcrp1의 대체 발기인 사용 및 전사 규정을 발견 할 수

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for functional genomics studies. While most cloning strategies are simple to perform, they generally use multiple steps and can require several days to generate the ultimate constructs. The method presented here is based on DNA assembly and can produce fully functional CRISPR vectors in a single cloning reaction. Vector construction can also be pooled, further increasing the efficiency and utility of the process. A modification of the method is used to create CRISPR vectors with multiple gene targets. CRISPR vectors are then transformed into tomato hairy roots to generate transgenic materials with targeted DNA modifications. Hairy roots are a useful system for testing vector functionality as they are technically simple to generate and amenable to large-scale production. The methods presented here will have wide application as they can be used to generate a variety of CRISPR vectors and be used in a wide range of plant species.

Using DNA assembly, multiple CRISPR vectors can be constructed in parallel in a single cloning reaction, making the construction of large numbers of CRISPR vectors a simple task. Tomato hairy roots are an excellent model system to validate CRISPR vectors and generate mutant materials.

토마토 털이 뿌리의 생성에 의한 높은 처리량 CRISPR 벡터 건설 및 DNA 수정의 특성

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...