이 방법은 우유 를 빨아 뇌의 스트레스 신호에 영향을 미치는 방법에 대한 산후 개발 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 첫번째 자연적인 기아 기간 도중 특정 두뇌 지역을 포착하고 첫번째 자연적인 초유 공급 직후에 각자의 지역에 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 빨아들이는 것이 행동과 감정의 생리학에 어떤 영향을 미치는지 이해하면 전 생체 공학 뇌 조직 분석 중에 다양한 수용체에 길항제를 사용할 수 있습니다.
핵 펀치를 얻으려면 장갑을 낀 손으로 꼬리로 쥐 새끼를 제거하십시오. 뇌를 수확한 후, 전체 장기를 실온에서 폴리메틸 메타크라이레이트 뇌 몰드에 빠르게 배치하고 새로운 면도날을 사용하여 500마이크로미터 두께의 조직을 만듭니다. 조각이 페트리 접시에 있는 코달에 놓아, 섹션의 올바른 방향을 유지한다.
전체 뇌가 절제되었을 때, 신속하게 접시에 포도당없이 인공 뇌 척수액을 추가하고 궤도 셰이커에 일정한 교반과 섭씨 28 ~ 30도에서 60 분 동안 슬라이스를 배양. 각 조직에 뇌 아틀라스와 해부학 적 랜드 마크를 사용하여 펀치 할 뇌 핵을 식별하고 해부 현미경에서 새로운 페트리 접시에 관심의 핵으로 슬라이스를 배치합니다. 일단 시각화되면, 빠르게 4 ~ 6 개의 다른 핵을 펀치하고 신속하게 60 분 동안 프로테우스 억제제와 인산 억제제를 포함하는 적절하게 표지 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 얼음 차가운 단백질 추출 버퍼의 0.06 mL에 각 펀치 핵을 몰입하는 코링 도구를 사용합니다.
인큐베이션의 끝에서, 냉각 된 미니 원심 분리기에서 추출 된 핵을 원심 분리하고 마이크로 파이펫을 사용하여 각 튜브에서 0.055 mL의 상신체를 얼음에 적절한 미리 냉각 된 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 조심스럽게 전송합니다. 음의 섭씨 20도 저장전에, 첫 번째 샘플 준비를 위해 얼음에 적절한 0.5mL 사전 냉각 튜브로 각 단백질 스톡 튜브에서 0.012 mL의 상퍼를 전송합니다. 모세관 단백질 측정을 위한 샘플을 준비하려면 단백질 용해 키트에서 0.5mL 표지튜브의 각 샘플에 0.003 mL의 마스터 믹스 시약을 추가합니다.
다음으로, 0.016mL의 산화수에 바이오티니화 분자량 사다리 용액에 마스터 믹스 시약0.004mL를 추가하고, 사다리와 단백질 추출물 샘플을 섭씨 95도의 열블록에 분해하여 5분 후에 4도의 모든 튜브를 저장합니다. 신호 단백질 분석을 위해, 새로운 자동화 된 서양 판의 E-1에 E-1에 우물 E-1에 새로 준비 된 루미놀 과산화수소 용액의 0.01 mL을 추가하고, D-2에서 D-25까지 이차 항마우스 항체의 0.01 mL을 추가하고, 1-1에서 D-1에 이르기까지 스트렙타비딘 고추의 0.01 mL를 추가하십시오. C-25에 새로 준비된 1차 항체의 0.01 mL을 C-2에 넣고, 항체 희석제 의 0.01 mL을 B-25에 B-1로 잘한다.
행 F 웰을 비워 두고 0.45mL의 세척 버퍼로 F 행 아래 세 행의 5개의 구획을 채웁니다. 다음으로, 냉장 된 샘플을 30 초 동안 잠시 회전시키고 A-2로 시작하여 각 샘플의 0.03 mL을 행 A에 추가합니다. 그런 다음 생체화 분자량 사다리의 0.005 mL을 잘 A-1에 추가하고 원심 분리를 위해 플레이트를 덮습니다.
플레이트가 원심 분리되는 동안 자동화된 서부 관련 소프트웨어에서 새 실행 파일을 열고 분자 크기 분석기를 시작합니다. 분석 페이지에서, 각 모세관뿐만 아니라 1차 및 이차 항체의 이름으로 샘플 이름을 입력합니다. 원심 분리의 끝에, 자동화 된 서양 악기에 접시를 배치하고 모세관 카트리지 상자에서 덮개를 벗깁니다.
원심 분리에 따라 모세관의 기포가 전동 전류를 차단하고 전체 라운드를 실패할 수 있기 때문에 기포를 검사하는 것을 잊지 마십시오. 카트리지를 계측기 내의 지정된 위치에 삽입하고 문을 닫습니다. 시작을 클릭합니다.
분석 유형으로 메시지가 표시되면 실험 이름을 적절한 텍스트 상자에 입력하고 확인을 클릭합니다. 활성화된 실행 날짜와 실행 파일의 ID 번호로 메시지가 표시되면 실행이 끝나는 시간을 기록합니다. 실행의 끝에서, 날카로운 처리에 모세관 카트리지를 버리고 생물 유해 물질 처분에 접시를 폐기.
전기전도 분리 후, 인광성 진핵 번역 개시 인자 2A를 의미하는 40~43킬로달톤에서 항원의 면역 반응성 피크에 대한 실행 파일을 확인한다. 이 크기의 분자량 피크가 누락된 경우 곡선 아래를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 분자량을 피크에 추가하여 곡선 아래의 크기와 임의수량을 기록합니다. 비프라임조직 샘플 내에서, 독방 트랙의 핵에 있는 결합 아미노산 글로불린 단백질 수준은 다른 모든 지역에 비해 상당히 높다.
초유를 가진 창자 조직의 프라이밍은 독방 트랙의 핵에 결합 하는 아미노산 글로불린 단백질 수준을 감소 하 고 심방 핵및 초광학 핵에 영향을 주지 않습니다. 반대로, 프라이밍은 비프라임 조직에 비해 피질 내의 결합 아미노산 글로불린 단백질 수준을 증가시키고, 다양한 테스트된 뇌 핵에서 결합하는 아미노 글로불린 단백질 수치가 장 프라이밍에 다르게 반응하고 아직 테스트된 다양한 핵 간의 크로스토크가 없다는 것을 암시한다. 진핵 번역 개시 인자 2A 및 인광진 진핵 번역 개시 인자 2A 수준은 다른 핵에 비해 비프라임 된 상태에서 상승된다.
프라이밍 후, 진핵 번역 개시 인자(2A)와 인광성 진핵 번역 개시인자(2A)의 수준은 원시조직에 비해 고독한 트랙의 핵에 비해 감소된다. 다른 모든 시험된 핵에서, 프라이밍은 무원시 조직에 비해 진핵 번역 개시 인자 2A 및 인광성 진핵 번역 개시 인자 2A의 수준을 증가시킨다. 그러나, 인계 단백질 키나아제 수용체의 수준은 독방 트랙의 핵에 있는 프라이밍 된 견본에 비해 비프라이드 샘플에서 낮으며, 다른 키나아제는 진핵 번역 개시 인자 2A의 인산화에 관여한다는 것을 강력하게 시사한다.
개발 후, 이 기술은 조직 성장과 분화에 관련되었던 신호 통로를 탐구하기 위하여 산후 발달의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장하고 그(것)들이 빨기의 영향을 받거나 독립적인지. 예를 들어, 디티오스레이톨과 같은 휘발성 감소제와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 이 절차를 준비할 때 화학 후드의 준비와 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
