인공 핵산 전사인자를 이용한 중합효소 활성조절방안을 제안한다. 이 유전자 규제 아키텍처는 체외 유전 적 장치를 위한 미래 를 위한 빌딩 블록역할을 할 수 있습니다. DNA 결합 도메인을 T7 RNA 폴리머라아제에 스테더링하여, 이 기술은 DNA 기반 회로의 확장성과 전사 회로의 기능을 결합합니다.
테이블에 표시된 바와 같이, 5에서 1 대 5 비율로, 이중 증류수의 50 마이크로 리터의 최종 부피에 단일 좌초 BG 올리고 뉴클레오티드의 9 희석을 함으로써 시작합니다. BG 올리고뉴클레오티드 의 4개의 마이크로리터와 SNAP 버퍼의 2개의 마이크로리터, 그리고 SNAP T7 RNAP의 4개의 마이크로리터를 혼합해서 각 희석에 대하여 1개의 반응 혼합물을 준비합니다. 올리고뉴클레오티드를 이중 증류수로 대체하여 RNAP 제어를 준비하고, SNAP T7 RNAP를 이중 증류수로 대체하여 DNA 제어를 준비합니다.
각 샘플의 마이크로리터 2개와 SNAP 버퍼 4개 소리터, 샘플당 단백질 로딩 염료 2개에 첨가하여 11개의 반응을 설정합니다. 70도에서 10분 동안 반응을 가열한 후 각 샘플의 마이크로리터 2개를 4~12%의 유리체 단백질 젤에 적재하여 200볼트의 얼음에 젤 전기포아를 35분간 적재합니다. 실행이 끝나면 세척당 적어도 10 분 동안 셰이커에 3 개의 물 교환으로 젤을 씻고 핵산이 15 분 동안 시아닌 염료로 염색합니다.
적절한 젤 이미징 시스템에서 젤을 이미지화하고 쿠마시 블루의 20 밀리리터로 젤을 다시 얼룩지게 합니다. 1 시간 후, 다시 젤을 이미징하기 전에 적어도 한 시간 동안 이중 증류수로 얼룩을 해제합니다. 올리고뉴클레오티드 테더드 SNAP T7 정제의 경우, 먼저, 1개의 어형량 50마이크로리터를 5개의 어금니 나트륨 염화나트륨 100마이크로리터와 850마이크로리터의 이중 증류수와 혼합하여 용출 완충제를 준비한다.
다음으로, 샘플당 1개의 이온 교환 컬럼을 개별 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣고, 각 열에서 모든 버퍼가 출동될 때까지 원심분리로 매립 버퍼로 컬럼을 세척한다. 각 샘플을 3 내지 1정정제 버퍼에서 샘플 비율로 희석하고 400마이크로리터의 샘플을 각 컬럼에 로드합니다. 모든 버퍼가 설명된 대로 용출된 경우 각 샘플에 대해 흐름을 수집하고 레이블을 지정합니다.
모든 버퍼가 세척당 용출될 때까지 세척당 400 마이크로리터의 정제 버퍼로 컬럼을 세 번 세척하여 흐름 스루를 적절히 수집하고 라벨링합니다. 마지막 세척 후, 열의 중앙에 용출 완충제 50 마이크로리터를 추가하고, 버퍼의 모든 50 마이크로 리터가 용출 될 때까지 컬럼을 세 번 원심분리하여 용출 단백질을 수집합니다. 각 원심 분리 후 엘루스를 수집하고 라벨을 지정하여 마지막 원심 분리 후 단일 튜브로 엘루스를 풀링하고 젤 분석을 위해 각 엘ute의 소량을 남깁니다.
260 및 280 나노미터에서 나머지 엘루트 알리쿼트의 흡수도를 측정하고, 사용 전까지 영하 20도 저장을 위해 1대 1 비율로 시료에 글리세롤을 추가합니다. 500 마이크로리터 30킬로달톤 경질 필터 유닛을 사용하여 총 elute 제품을 2배 스토리지 버퍼로 교환합니다. 그리고 입증된 바와 같이 흡광도를 측정합니다.
그런 다음 영하 20도 저장을 위해 일대일 비율로 제품에 글리세롤을 추가합니다. SDS-PAGE에 의해 엘ute를 평가하기 위해, 200 볼트에서 35 분 동안 또는 염료 전면이 젤의 끝으로 이동 할 때까지 4 ~ 12 %유리체 젤에 적절한 단백질 사다리에서 샘플을 실행합니다. 테더드 RNAP의 온디맨드 제어 활성을 입증하려면 각 템플릿의 2.4 마이크로리터를 5배 의 소리터 5개, 이중 증류수 14.2마이크로리터와 혼합합니다.
결과 1개의 마이크로몰러 이중 좌초 DNA CAGE를 섭씨 75도에서 2분 동안 배양합니다. 그리고 표에 표시된 것과 동일한 방식으로 프로모터 및 말라카이트 녹색 aptamer DNA 템플릿의 감각과 반감각 균주를 음침한다. 인큐베이션의 끝에서, 500 나노 몰러 RNAP의 최종 농도에 1 ~ 5 어금니 비율로 이중 좌초 된 DNA 케이지에 테더드 된 SNAP T7 RNAP를 추가합니다.
실온에서 15분 후, 얼음에 샘플을 놓고, 25 밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염의 1개의 마이크로리터, 1밀리머 말라카이트 녹색의 1개의 마이크로리터, RNAP CAGE 혼합물의 2.5 마이크로리터, 2.5 마이크로리터, 1개의 마이크로모클레오 크로니티어, 2.5 마이크로리터 각각 1개의 마이크로모클레오 크로니톤 및 1개의 마이크로모클레오 크로니티드 비디온 인자 A 이중 증류수 10마이크로리터에 1밀리몰러 말라카이트 녹색 압타머 템플릿3개. 이중 증류수 15마이크로리터에서 체외 전사 완충제 10x의 2.5 마이크로리터, 25밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염 믹스 1편, 밀리머 말라키테 그린 1개, 마이크로리터 1개, RNAP CAGE 혼합물 2.5 마이크로리터, 3개의 마이크로리터를 포함하는 두 번째 반응을 설정합니다. 완충액만 함유한 반응을 설정하려면 시험관내 전사 완충제에 10x의 마이크로리터 2.5마이크로리터, 25밀리머 리보뉴클레오사이드 삼중산염 믹스 1개, 밀리머 말라카이트 그린 1개 마이크로리터, 17.5 마이크로리터 1밀리미터 의 마이크로리터를 혼합하여 17.5 마이크로리터의 이중 화분으로 사용할 수 있습니다.
모든 반응이 준비되면 각 반응을 384웰 플레이트로 옮기고, 610나노미터 발암시 37도에서 2시간 동안 형광판 판독기에 말라카이트 녹색 이타수 전사를 모니터링하고 655나노미터 방출을 한다. 판독의 끝에서, 얼음에 접시를 놓고, 20 분 동안 280 볼트에서 70 섭씨 TBE 버퍼에 12 %TBE 우레아 폴리 아크릴 젤에 각 우물에서 RNA 제품을 실행, 또는 염료 전면이 젤의 끝에 도달 할 때까지. 그런 다음, 시안염 핵산 얼룩으로 젤을 궤도 셰이커에 10분 동안 얼룩지게 한 후, 이미징을 시연한 바와 같이.
재조합 SNAP T7 RNAP 단백질의 성공적인 발현 및 정제는 SDS-PAGE를 사용하여 확인할 수 있다. SDS-PAGE에 이어, 효소 활성은 체외 전사 반응에 의해 검증될 수 있다. BG 기능성 올리고뉴클레오티드의 성공적인 결합은 18%의 TBE-urea PAGE를 통해 검증될 수 있다.
수정되지 않은 올리고뉴클레오티드에 비해, 올리고뉴클레오티드에 BG 모에티를 첨가하면 분자량이 증가한다. 본 대표적인 시아닌 염료 얼룩 젤에서 관찰된 바와 같이 과잉 BG 올리고뉴클레오티드로부터 DNA 테더드 T7 RNAP 정제를 확인하듯이, 분획을 통한 초기 흐름은 대부분 과잉 BG 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 양이온 교환 수지에 결합하지 않은 DNA 테더폴리라제의 작은 부분을 함유했다. 풀 희석 분획은 올리고뉴클레오티드 밧줄에 결합된 시아닌 염료에 의해 야기된 RNAP 올리고의 단일 밴드만 포함되었으며, 업 농축 된 제품 레인은 동일한 것을 나타내지만 어두운 밴드는 성공적인 업 농도를 나타냅니다.
동일한 패턴은 쿠마시 블루 스테인링에 의해 관찰되며, 작은 겔 이동성 변화는 비 컨쥬게이드 RNAP 제어에서 관찰된다. 여기서, 실시간 운동학에서 시험관 내 전사의 끝에서 생성된 형광 신호가 도시된다. 본 분석에서, 형광 신호에서 336배의 활성화가 관찰되었고, 중합활성의 견고한 제어를 입증하였다.
이 프로토콜을 시도할 때 핵산 염색 전에 젤에서 SDS를 철저히 씻어야 합니다. 이는 STS가 젤의 염료를 포획하여 높은 배경 신호를 생성하기 때문입니다. 여러 캐스케이드가 있는 대형 유전자 회로에 당사의 방법을 적용하면 테더드 전사 시스템의 확장성과 합성성을 보여줄 수 있습니다.
이 기술은 현재 신경망 스타일 계산이 가능한 유전자 회로를 개발하는 데 사용되고 있습니다.
