이 컨포칼 현미경 프로토콜은 안료의 자가형광을 사용하여 실험실에서 느리게 성장하는 극한 환경에서 미세조류의 생태학적 거동과 적응을 해석할 수 있도록 합니다. 이 기술은 침습적이지 않으며 화합물이 사용되지 않기 때문에 인공물을 최소화합니다. 독립 영양 생물의 색소의 성능과 그에 상응하는 성장을 알면 관광 동굴과 건축 기념물에 가장 큰 관심을 갖는 제어 방법을 설계 할 수 있습니다.
Chroothece mobilis의 접종물을 한천 배양에서 해수 배지 또는 SWES 액체 배지로 옮겨 준비하기 시작합니다. 모든 배양물을 낮은 백색광 강도 하에서 섭씨 20도에서 16 내지 8의 밝은 어두운 사진 주기로 2주 동안 유지하고 원하는 세포 밀도가 얻어질 때까지 진탕하지 않고 유지한다. 1 밀리리터의 지수 페이즈 배양물을 사용하여 10 내지 3 밀리리터 당 세포 밀도를 5배로 하여 상이한 실험을 위해 24-웰 플레이트에 접종한다.
단색 조명 효과를 재현하려면 녹색 필터를 사용하여 녹색 빛이 470에서 570 나노 미터까지 통과하고 506 나노 미터 파장에서 피크가 있고 590에서 720 나노 미터 사이의 필터를 사용하여 조정 된 적색광과 678 나노 미터에서 피크를 사용합니다. 세포 배양액을 이 빛에 2주 동안 노출시킨다. 레이저를 포함한 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경의 모든 구성 요소를 켭니다.
이미징을 위해 24-웰 플레이트의 각 실험 웰에서 SWES 성장 배지의 세포를 35mm 유리 바닥 접시에 장착합니다. 63X 또는 1.30 개구수 조리개 또는 NA 글리세롤 이멀젼 대물렌즈를 선택하고 렌즈 위에 글리세롤을 놓습니다. 다음으로, 현미경 스테이지에 웰 플레이트를 놓아 이미지 획득 중에 표본이 움직이지 않도록 합니다.
표본을 빛의 경로 중앙에 놓고 형광 강도가 가장 높은 평면을 선택하여 세포 중심에 초점을 맞춥니다. 완료되면 이미지 획득 소프트웨어를 열고 획득 모드의 드롭다운 목록에서 XY lambda를 선택합니다. 레이저 561 나노 미터, 8 비트의 다이내믹 레인지 및 1024 x 1024 픽셀의 여기 라인을 선택하십시오.
570 내지 760 나노미터 범위 내에서 10 나노미터 대역폭 및 4 나노미터의 람다 스텝 크기에서 형광 방출 스펙트럼을 수집한다. 하나의 에어 유닛에 핀홀을 설정하고 람다 스캔 수집을 실행합니다. 다른 시야와 빨간색과 녹색 표시등의 다른 조건에서 이 과정을 반복한 후 모든 데이터를 저장합니다.
람다 스캔이 수집되면 소프트웨어 상단의 정량화 창을 클릭하여 수집된 형광 방출 스펙트럼을 평가합니다. 열려 있는 프로젝트 창으로 이동하여 하나의 XY 람다 파일을 선택합니다. 이미징 소프트웨어에서 스택형 프로파일 분석을 선택하고 셀 중앙에 4마이크로미터 정사각형의 관심 영역을 정의하여 평균 형광 강도를 분석합니다.
다른 조건에서 다른 셀로 프로세스를 반복하기 전에 데이터와 CSV를 내보냅니다. 그런 다음 CSV 파일을 열어 CSV 파일에서 각각 phycoerythrin phycocyanobilin, C.phycocyanin, allophycocyanin 및 chlorophyll A의 최대 형광 데이터를 선택하여 측정된 모든 관심 영역의 다른 형광 방출 피크를 선택합니다. 완료되면 각 phycobiliprotein 및 엽록소 피크에서 얻은 모든 최대 형광 값이 포함된 새 테이블을 만들고 데이터를 그래프에 표시합니다.
평균 형광 강도의 유의한 차이가 관찰되었습니다. phycoerythrin phycocyanobilin의 평균 형광 강도는 세포가 단색 녹색광에 노출되었을 때 유의하게 감소했습니다. 대조적으로, 대조군과 비교하여 적색광에서는 차이가 관찰되지 않았다.
녹색 빛은 알로피코시아닌과 엽록소 A에 반대 효과를 나타냈는데, 이는 특히 안테나 복합체의 양 증가 또는 연결성 향상으로 인한 안테나 복합체의 적응으로 인해 평균 형광 강도가 크게 증가했습니다. 적색광은 알로피코시아닌과 엽록소 형광의 유의하지 않은 증가를 일으켰습니다. 다양한 성장 조건이 배양 중인 세포에 미치는 영향을 연구하려면 정확히 동일한 현미경 설정으로 측정을 수행하는 것이 중요합니다.
자가형광 유기체의 배양과 관련된 다른 환경 파라미터와 가시광선 스펙트럼 내의 형광 신호를 분석할 수 있습니다. 이 기술은 여러 자가형광 색소를 갖는 연구 생명체 유기체에 대한 매우 강력한 접근 방식입니다.
