Rhodopsin 잘못 접는 것은 망막 색소증에게 불린 진보적인 망막 변성을 일으키는 원인이 됩니다. 전통적인 이미징 방법은 rhodopsin 수송을 정량화하는 능력이 제한되어 있지만, 새로 개발된 이미지 기반 분석법은 높은 처리량 스크리닝을 허용하여 거짓 긍정을 제거합니다. 이 기술은 약물 약역학의 빠른 평가를 허용합니다.
질병을 일으키는 rhodopsin의 접이식을 구출하는 눈에서, 따라서 조용히 치료할 수 없는 눈부신 질병, 망막색 색소증에 대한 처리를 위한 잠재력을 가속화합니다. 막 단백질의 세포 지역화는 그 기능에 매우 중요합니다. 이 방법은 관심있는 다른 멤브레인 단백질의 수송을 정량화하기 위해 쉽게 변형되고 적용 될 수 있습니다.
플레이트 맵을 준비하고 각 플레이트웰에서 액체를 부드럽게 추가하고 흡인하여 세포 수와 세포 간의 일관된 면역 상태 조건을 유지해야 합니다. 이렇게 하면 Z 계수가 높고 신뢰할 수 있는 결과가 생성됩니다. 시작하려면, 씨앗 5000 세포는 검은 벽으로 잘 당 5000 세포, 명확한 바닥, 폴리 리신 처리 384 잘 플레이트.
37°C의 플레이트를 37°C의 큐베이션으로 5% CO2로 3시간 동안 배양하여 세포가 플레이트 바닥에 부착합니다. 다음으로, 여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 플레이트 맵에 따라 멀티채널 파이펫을 사용하여 5배 작업 솔루션의 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 이제 22및 24개의 열에 2%DMSO의 웰당 10개의 마이크로리터를 추가합니다.
또한, 희미한 빨간 빛 아래 어두운 방에 25 마이크로 몰러 9 시스 망막의 우물 당 10 마이크로 리터를 추가합니다. 다양한 테스트 화합물을 모두 적재하면 알루미늄 호일로 플레이트를 덮고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 어두운 방에서 384개의 잘 접시를 꺼내어두운 붉은 빛이 켜집니다.
여기서, 진공 수집 병에 연결된 8 채널 아스피라기를 사용하여 접시의 우물에서 매체를 부드럽게 흡인시합니다. 다음으로, 멀티채널 파이펫을 사용하여 새로 준비된 4%파라포름알데히드의 웰당 20마이크로리터를 전체 384웰 플레이트에 추가하고 실온에서 20분 동안 셀을 수정합니다. 고정 후 접시를 일반 빛에 놓습니다.
8채널 아스피러를 사용하여 각 우물에서 파라포름알데히드를 흡인하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 PBS 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. PBS를 총 3회 세척 주기로 대체합니다. 그런 다음 각 우물에 5%의 염소 세럼의 우물 당 20 마이크로리터를 추가하고 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션에 따라, 우물을 흡인하고, 밀리리터 B630 항로도프신 항체당 20 마이크로리터 15마이크로리터를 O.Next행의 우물에 1%염소 세럼을 추가하고, 이차 항체 전용 대조군을 위해 P행에 15마이크로리터를 추가한다. 플레이트를 실온에서 90분 또는 밤에섭씨 4도에 배양합니다. 그런 다음, 형광의 광표백을 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 덮는다.
다음으로 PBS 웰당 50 마이크로리터로 플레이트를 세 번 씻으시다. 마지막 세척에 이어, PBS를 흡인하고, Cy3-conjugated 염소 안티 마우스 IgG 항체의 밀리리터 당 5 마이크로그램의 웰 당 15 마이크로 리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 샘플을 1 시간 동안 배양하십시오.
인큐베이션에 이어 접시를 세 번 씻으시다. 그런 다음 PBS 웰당 50 마이크로리터를 추가하여 실온에서 Hoechst 얼룩의 밀리리터 당 1 마이크로그램을 15 분 동안 포함시합니다. 마지막으로, 투명 필름으로 웰 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일로 덮고 최대 1 주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오.
호일을 제거하고 샘플 플레이트를 고함량 이미저에 넣고 A1은 플레이트왼쪽 상단에 배치합니다. 그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 열어 이미지 수집을 위한 매개 변수를 설정합니다. 플레이트 획득 설정 창을 열고 새 설정을 만들거나 기존 설정 파일을 로드합니다.
20X 목표를 선택하고 픽셀 비닝을 2개로 설정하므로 보정된 픽셀 크기는 0.80 x 0.80 미크론입니다. 그런 다음 스캔 선을 2000으로 설정하고 이미지 크기를 사이트당 1000x 1000픽셀로 설정합니다. 다음으로, 이미지할 플레이트 유형을 선택합니다.
제조업체에서 제공한 정보를 사용하여 플레이트 치수를 채웁니다. 이제 이미지할 우물을 4개의 사이트와 함께 선택하여 잘 이미지할 수 있습니다. 포부 팁에 의해 감동 우물의 측면을 피하십시오.
이미징의 경우 405, 488 및 461 나노미터로 여기 레이저를 선택합니다. 그런 다음 DAPI, FITC 및 텍사스 레드 채널의 배출 필터를 선택합니다. 레이저 전력과 각 채널의 이득을 최적화하여 긍정적인 제어 우물이 포화되지 않도록 합니다.
자동 초점에 초점을 잘 잘 선택합니다. 그런 다음 획득할 초기 웰을 선택하고 모든 사이트에 대해 사이트 자동 포커스를 설정합니다. 또한 각 채널에 대해 회당 평균 4개를 선택하고 각 채널에 대한 Z 오프셋 값을 최적화합니다.
테스트된 모든 우물에 이미지가 초점을 맞추고 있는지 확인하기 위해 플레이트 모서리에 2~3개의 우물을 먼저 테스트하여 모든 것이 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 잘 당 모든 사이트에서 그 이미지는 40 % 이상의 합류와 세포를 가지고 있는지 확인합니다. 마지막으로, 모든 채널의 형광 강도가 모두 100% 제어 우물에서 약 절반포화상태임을 확인합니다.
그런 다음 이미지 수집 방법을 저장하고 전체 플레이트를 실행합니다. 이미저를 떠나기 전에 플레이트의 첫 번째 열에서 이미지 캡처가 끝날 때까지 이미저를 보고 이미지 품질을 다시 확인합니다. 완료되면 접시를 제거하고 나중에 사용하기 위해 섭씨 4도에 보관하십시오.
고함량 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 데이터를 가져옵니다. 열 23에서 100% 제어 우물 중 하나를 선택하여 매개 변수를 설정합니다. 먼저 다중 파장 셀 채점을 분석 방법으로 선택하고 추가 설정을 구성합니다.
DAPI 채널의 이미지를 사용하여 핵을 정의합니다. 미리 보기, 선택된 핵 의 정의된 핵 형상이 핵 이미지와 잘 잘 맞는지 확인한다. 다음으로, 로도신 비너스가 이미지되는 FITC 채널에서 셀 모양을 정의합니다.
이를 위해 각 셀의 최소 및 최대 직경, 배경 위의 최소 형광 강도 및 각 셀의 최소 영역을 설정합니다. 이제 텍사스 레드 채널의 진도 세포 표면 얼룩 영역을 정의하여, 세포 모양의 최소 및 최대 직경, 배경 위의 미늄 형광 강도, 각 스테인드 셀의 최소 영역을 설정하여. 현재 알고리즘을 5개의 우물에서 테스트하여 설정이 최적화되었는지 확인합니다.
그런 다음 설정을 저장하고 구성 창을 닫습니다. 최적화된 분석 방법으로 모든 웰을 실행합니다. 완료되면 개체 번호를 그대로 셀 번호로 내보냅니다.
FITC 채널의 평균 강도를 Rhodopsin 금성 강도로 내보내고 텍사스 레드 채널의 평균 강도를 세포 표면에 로도신 강도로 내보냅니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 각 매개 변수에 대해 2색 열 맵을 생성합니다. x축에 셀라인의 이름과 y축의 화합물을 정렬합니다.
여기서, P23H rhodopsin 금성의 우리의 심상은 녹색에 있는 금성 형광을 표현하고, 세포 표면 면역 염색을 적색으로 표현하는 U2OS 세포를 취급했습니다. 세포는 DMSO 또는 5개의 마이크로몰러 9-시스 망막으로 처리되었습니다. rhodopsin 전송 분석, 다양 한 조건 하에서 전체 세포에 진 통 양을 비교, P23H 돌연변이 세포주에서 상당한 회복을 보여줍니다., 9 시스 망막으로 처리 하는 경우.
또한, 세포 표면의 진도 강도, 및 전체 세포에서 진도상가금강도에 세포 표면에 진통 얼룩의 비율은, DMSO로 처리된 야생형 rhodopsin에 비해 P23H 돌연변이에 대해 현저히 낮지 않다. 히트 맵은 여러 돌연변이체에서 셀당 평균 진도 양과 지역화를 비교하는 효율적인 방법입니다. 여기서, 야생형 대조군 및 6개의 진통 돌연변이는 수평으로 나열되고, 화합물 처리의 효력은 수직으로 비교됩니다.
이전 연구에 동의하여, 세포 표면의 진도 강도및 세포 표면에 진통 얼룩얼룩의 비율은 Rhodopsin 금성 강도에 DMSO로 처리된 야생형에 비해 6개의 돌연변이체에 대해 더 낮습니다. 화합물 1, 2, 6 및 9크게 T4R, P23H, D190N 및 P267L 진도 선 돌연변이체에서 진도 핀 금성 강도 세포 표면에 진통 얼룩의 비율을 증가, 이러한 화합물은 플라즈마 막에 이러한 진도 돌연변이의 수송을 구출 제안. 이 이미지 분석에 중요 하기 때문에, 그 세포는 고정 하기 전에 50 그리고 70%의 컨할 필요가 있습니다.
또한, 우리는 전체 접시에 걸쳐 우물의 이미지를 보여 주었다. 초점이 맞추어진 이미지와 종료되지 않는 형광에 모든 채널에 대한 모든 임계값이 있는지 확인합니다. 선택 화합물까지, 그 구조 잘못 주름 진 rhodopsin 수송, 우리는 과정을 검증 할 수 있습니다, 다음 진도 P23H 돌연변이를 표현하는 마우스 모델을 사용하여, 생체 내에서 이러한 화합물의 효능을 전달.
이 방법을 통해 멤브레인 단백질 량과 현지화를 정량화할 수 있습니다. 따라서, 그것은 보조 저장 및 저하 당 막 단백질에서 시작 된 마이크로 실수에 대 한 좋은 도구. 파라포름알데히드는 이 실험에서와 마찬가지로 이 시약처리를 포함하는 절차를 가지고 있습니다.
그것은 후드에서 수행됩니다. 이 시약을 포함한 폐기물은 유해 화학물질로 적절히 폐기해야 합니다.
