이 프로토콜을 사용하여, 우리는 처음으로 타타르 메밀에 털이 뿌리를 유도하기위한 단계별 과정을 시연 할 것입니다. 이 기술은 타타르 메밀 및 기타 식물을위한 유전체학 및 미생물학을 시작하기에 쉽고 저렴합니다. 이 상세한 방법은 타타르 메밀에 대해 설정되어 있지만, 일부 수정과 다른 디코 식물에 적용 할 수 있습니다.
이 방법은 수행하기 쉽지만 많은 세부 단계가 있습니다. 시각적 데모는 연구원이 보다 효율적인 털이 많은 뿌리 유도를 달성하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 석사 학생 인 광타오 첸 (Guangtao Qian)이 될 것입니다.
통통하고 손상되지 않은 타타르메밀 씨앗을 선택하고 약 20 분 동안 섭씨 28도의 물에 씨앗을 담그는 것으로 시작합니다. 종자 외투를 쉽게 제거할 수 있는 경우, 껍질을 벗긴 씨앗100~200개에 75%에탄올을 함유한 멸균 된 원추형 플라스크에 30초 간 놓습니다. 살균이 끝나면 에탄올을 5%의 하이포염 나트륨으로 대체하십시오.
15 분 후, 나트륨 hypochlorite을 데산하고 멸균 분물로 씨앗을 5 번 씻습니다. 그런 다음 멸균 이불 종이 조각으로 씨앗을 건조. 타타르메밀 모종을 얻으려면 MSSA 배지 50 밀리리터를 함유한 개별 300 밀리리터 식물 조직 배양 병에 병당 10개의 씨앗을 추가합니다.
그런 다음, 25, 플러스 또는 영하 1도, 빛 조건하에서 문화실에서 씨앗을 발아. 7~10일 후에는 두 장의 전개된 코틸레톤으로 견고한 묘목을 선택하고 뿌리에서 묘목을 잘라냅니다. 모종을 멸균 페트리 접시에 넣고 고압을 0.8~1센티미터 세그먼트로 자른다.
코틸레던을 약 0.5센티미터 의 조각으로 깎아 넣고 24시간 동안 광 조건에서 이출되는 것을 미리 배양합니다. 다음 날, 이불을 살균된 100밀리리터 원추형 플라스크로 옮킨다. A.rhizogenes를 활성화하려면, 균등하게 28섭씨에서 12~16시간 배양에 대한 항생제로 YEB 고체 배지에 박테리아를 도금하기 전에 얼음에 대한 배양을 해동하십시오.
다음 날 아침, 방금 보여준 것처럼 새로운 페트리 접시에서 문화를 위한 단일 클로날 식민지를 선택하십시오. 또 다른 12~16시간 배양 후, 항생제28도, 분당 200회전을 함유한 살균된 100밀리리터 원추형 플라스크에서 생성된 단일클론 콜로니를 접종하여 600의 광학 밀도가 2.0에 도달할 때까지 분당 16~18시간 동안 200개의 회전을 한다. 그런 다음 세균 세포 배양의 2-4%를 항생제로 20밀리리터를 함유한 새로운 100밀리리터 원추형 플라스크로 전송하여 600 나노미터의 광학 밀도가 약 0.5에 도달할 때까지 분당 28도 및 200회전을 약 0.5에 도달한다.
털이 많은 뿌리 변환을 유도하기 위해 A.rhizogenes 배양을 멸균 50 밀리리터 원문 튜브로 이송하고 원심분리에 의해 박테리아를 수집한다. MSSAS 매체에서 펠릿을 약 0.2의 광학 밀도로 재중단하고 현탁액을 이별의 플라스크에 주입한다. 10 분 후, 플라스크에서 이출을 제거하고 멸균 이불 종이 조각으로 얼룩.
그런 다음 멸균 직경 9센티미터의 필터 용지를 MSSAAS 배지 접시에 놓고 어두운 곳에서 섭씨 25도에서 3일 동안 필터 용지에 이파기를 오버레이합니다. 인큐베이션이 끝나면 약 20개의 감염된 이파를 MSSACK 배지로 옮기고 25° 또는 영하 1도의 가벼운 조건하에서 식물을 수직으로 배양한다. 문화의 10 ~ 14 일 후, 흰색 외관과 빠른 성장을 보여주는 털이 뿌리를 선택하고 2 ~ 3 센티미터 조각으로 뿌리를 잘라.
깨끗한 벤치에 뿌리를 분명히 번호를 매겨. MSSK 배지가 25도, 어둠 속에서 분당 80개의 회전을 함유한 살균된 100밀리리터 원추형 플라스크에서 뿌리 조각을 배양하여 플라스크 바닥으로 확산됩니다. 털이 많은 뿌리를 식별하려면 황갈색과 오염 된 털이 많은 뿌리를 제거하고 흰색 모양을 가진 뿌리를 선택하십시오.
기자 유전자가 사용되는 경우, 청색 또는 경이중 이중 울트라 바이올렛 트랜실루미네이터 하에서 형광에 대한 뿌리를 확인하고 강한 형광 신호를 나타내는 털이 많은 뿌리를 선택한다. 그런 다음 흡수성 종이로 뿌리를 건조하고 즉시 분석을 위해 표시된 알루미늄 호일로 감쌉합니다. 장기 저장을 위해 액체 질소의 뿌리를 lyophilize하고 조사 할 때까지 뿌리를 영하 80도에 놓습니다.
유전적 변형과 문화 가 입증된 바와 같이, 털이 많은 뿌리는 이병의 상처 부위에 푹신한 백색색과 플라지오트로픽 방식을 나타내고 고도로 분기되고 연동된 매트릭스를 형성할 것이다. 기자 유전자는 청색 또는 경색 이중 자외선 과균화 또는 관심 있는 표적 유전자의 식별 하에서 형질전환 털이 뿌리의 분화를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 여기서, 타르트 메밀 털이 뿌리의 트랜스제닉 라인에서 빛 유도 전사 인자의 상대적 발현이 나타난다.
특히, 루틴과 퀘르세틴의 생합성은 또한 유도된 전사 인자에 대한 반응으로 대사 수준에서 촉진된다. 또한, 3개의 형질대사에서 플라베노이드 합성 경로 유전자의 상대적 유전자 발현은 대조군에서 측정된 유전자보다 현저히 높으며, 타타르메밀 의 성공적인 털이 많은 뿌리 변환을 나타낸다. 즉, 씨앗의 감염, 이절의 선택, 박테리아의 농도는 직접 털이 뿌리 유도의 성공에 영향을 미친다.
우리는 전사 조절 이차 대사 산물을 연구하기 위해 유전자 발현, DNA 단백질 또는 단백질 단백질 반응 또는 이차 대사 산물의 대량 생산을 평가할 수 있습니다. 엔지니어링 된 박테리아는 인간과 그의 환경에 유해합니다. 박테리아를 제대로 처리하고, 조작하고, 폐기하십시오.
