이 프로토콜은 해양 무척추 동물을 위한 다루기 쉽고 널리 호환되는 1차 세포 배양 방법을 제공한다. 이 기술은 연구원에게 비교적 오랜 시간 동안 해양 무척추 동물 세포를 배양하는 방법을 제공합니다. 세포의 배양은 해양 생물학 연구에서 다른 추가 생물학적 실험 응용 프로그램에 대한 일관된 유전 적 배경을 제공해야합니다.
이 분야에 대한 새로운 연구에 따르면, 우리는 표시된 단순화 된 프로토콜이 운동하기에 좋은 선택이되어야한다고 믿습니다. 마취 후, 전위 내자를 해부하고 수집한 다음, 조직 샘플을 수직으로 절제하고 내부 내용을 제거합니다. PBS에서 조직 샘플을 두 번 세척하고 75% 에탄올 용액에 2초 이상 침수하여 소독합니다.
그런 다음 PBS에서 조직 샘플을 세 번 세척하여 에탄올을 제거하고 약 100 밀리그램의 조직 샘플을 2 밀리리터 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 전달합니다. 해삼 장 조직 블록에 미리 최적화된 배양 배지 1.5밀리리터를 넣고 용액이 흐릴 때까지 살균 수술 가위로 블록을 다진다. 0.25%의 트립신400마이크로리터를 추가합니다.
반전으로 용액을 섞고 실온에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 그런 다음 100 미크론 세포 스트레이너를 사용하여 용액을 필터링하고 새로운 멸균 2 밀리리터 마이크로 원심 분리튜브에서 여과물을 수집합니다. 선택적 단순화 프로토콜의 경우 배양 된 미디어에서 절단 된 조직 블록을 직접 요리로 옮기고 배양 할 수 있습니다.
1700xG에서 튜브를 3분 동안 원심분리하고, 상류제를 폐기한 다음, 항생제로 배양 배지에서 펠릿을 다시 중단하고 배양 배지로 두 번 세척한다. 세포 배양을 위한 인큐베이터를 미리 설정하고, 섭씨 18도의 온도와 포화 습도로 적어도 24시간 동안 미리 실행한다. 그런 다음 표시된 배지의 200 마이크로 리터를 사용하여 세포를 다시 중단하고 4 센티미터 요리로 옮습니다.
인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 6 시간 후, 인큐베이터에서 그들을 데리고 세포 배양 요리에 표시된 매체의 두 밀리리터를 추가합니다. 매 12 시간, 매체의 절반을 변경합니다.
5~7일 후에 세포가 분열되기 시작합니다. 배지에 표시된 항생제, 페니실린, 연쇄상 구균 및 젠타미신의 농도를 절반으로 줄임으로써 항생제의 부작용을 줄입니다. 2~3일마다 세포 배양 배지를 교체한다.
1 차 세포 밀도가 60 %에 도달하면 세포 통과를 실시합니다. 먼저, 실온에서 PBS를 사용하여 배양 된 세포를 두 번 씻는다. 각 접시에 0.25%의 트립신 솔루션200마이크로리터를 추가하고, 수동으로 접시를 교반하여 전체 바닥이 덮여 있는지 확인합니다.
트립신 용액을 버리고 실온에서 5 분 동안 세포를 배양합니다. 세포를 배관하고 다시 일시 중단하여 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 세포를 씻으시면 됩니다. 세포 현탁액0.5 밀리리터를 새로운 접시에 옮기는다.
신선한 배지 1.5 밀리리터를 추가하고 18°C에서 세포를 배양합니다. 12 시간 후에, 배지를 변경하고, 조건을 평가하기 위하여 현미경의 밑에 세포를 관찰합니다. 1개의 마이크로몰라및 100개의 마이크로몰라 deximethazone를 가진 대조군 및 2개의 해결책 단을 포함하여 3개의 실험 단을 준비합니다.
0, 24 또는 48 시간 동안 deximethazone의 유무에 관계없이 배양 한 후 PBS로 세포를 세 번 씻습니다. 빛을 끄고 12웰 플레이트에 잘 33258 용액 300 마이크로리터를 넣고 접시를 부드럽게 교반하여 모든 세포를 덮어 염색합니다. 섭씨 18도에서 30분간 배양하세요.
그런 다음 hoechst 염색 용액을 제거하고 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 용액의 300 마이크로 리터를 각각 우물에 추가하여 세포를 수정합니다. 15분간 부드럽게 동요합니다. 그 후, PBS에서 고정 된 세포를 세 번 세척.
세포를 덮어 두기 위해 마지막 세척 후 PBS를 유지하십시오. 수은 램프 전력, 형광광전력 및 PC를 포함한 형광 현미경 하드웨어를 켭니다. 운영 체제 계정에 로그인하고 소프트웨어를 실행하고 구성을 확인합니다. 준비된 접시를 현미경 단계에 놓습니다.
스테이지 컨트롤러를 사용하여 샘플을 객관적인 렌즈 위에 배치합니다. 빛 현미경에서 관심있는 세포를 찾을 수 있습니다. 형광 현미경으로 전환하고 핵 DNA 관찰을 위해 각각 약 352 및 461 나노미터로 발산 및 방출의 매개 변수를 조정한다.
이미지를 캡처합니다. 이 연구에서는 해삼의 1차 장세포 배양이 확립되고 통과되었다. 배양의 다른 단계에서 둥근 세포는 여기에 표시됩니다.
다음은 씨를 뿌려서 3일째 에 접시 바닥에 부착된 세포입니다. 다음은 7일째에 세포증식입니다. 다음은 패시징 후 요리의 바닥에 부착 된 세포입니다.
그리고 활동을 잃고 10 구절 후 죽어 가고 있었다 세포. EDU 진술 소사는 나중에 이 둥근 세포의 증식 활동을 밝히기 위하여 직접적인 증거를 제공합니다. 1개의 마이크로몰라 deximethazone를 가진 자극은 대조군 및 100 마이크로몰러 deximethazone 자극과 비교하여 가장 급속하게 세포 비율을 증가했습니다.
배양된 세포는 상이한 기간 동안 deximethazone로 처리되었고, 이어서 세포 검출을 위한 hoechst 33258 염색이 뒤따랐다. 인큐베이팅 전에 세포 치료는 장기 제어에 매우 중요합니다. 셀이 잘 자라지 않을 때 선택적 단순화 된 프로토콜을 시도하는 알림입니다.
Paraformaldehyde는 피부 접촉 또는 흡입에 의해 적당히 유독하며, 아마 인간 발암 물질로 문서화됩니다.
