이 프로토콜은 재료에 대한 지식이 있고 현미경과 완벽하게 호환되는 수백 개의 오가노이드의 성장을 위해 설계된 미세 질감 세포 배양 접시를 보여줍니다. 당사의 기술은 장기 이미징 및 장기 세포 배양과 완벽하게 호환되는 수천 개의 유기체를 효율적으로 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜은 약물 스크리닝 파이프라인 및 암 연구 영역과 같은 생물 의학 응용 분야에 큰 관심을 받고 있습니다.
이 프로토콜에 제시된 기술은 실험실 절차 및 광학 현미경 검사에 경험이있는 사람이라면 누구나 몇 번 시도하면 쉽게 마스터 할 수 있습니다. 시작하려면 PDMS 금형의 작은 부분을 최종 장치에 필요한 치수로 절단하십시오. 배열의 XY 방향과 평행하게 자릅니다.
준비된 PDMS 몰드 주사위 중 하나를 평평한 PDMS 섹션에 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 약 0.1 내지 0.2 밀리리터의 UV 경화성 접착제를 몰드의 한쪽면에 첨가한다. 10X 배율의 도립 광학 현미경을 사용하여 캐비티 내부의 액체 진행을 따르십시오.
접착제를 UV 광선에 노출시켜 경화시킵니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 UV 소스의 전력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 한쪽 가장자리에 과도한 양의 접착제를 사용하여 경화된 접착제를 손가락으로 부드럽게 눌러 평평한 PDMS 기판에 고정합니다.
한편, 핀셋을 사용하여 누르고 있는 동일한 가장자리 옆에 몰드의 한쪽 모서리를 집고 질감이 있는 필름이 들리지 않도록 하면서 몰드를 천천히 떼어냅니다. 면도날을 사용하여 과도한 접착제와 PDMS 기판을 트리밍하여 경화, 질감 및 접착층을 PDMS에 평평하게 놓고 여분의 기판은 한쪽 가장자리에만 둡니다. 짧은 산소 플라즈마 공정으로 깨끗한 커버슬립을 처리하여 친수성을 개선하십시오.
플라즈마 활성화 후, 표준 스핀 코터의 진공 척에 커버슬립을 놓고 커버슬립 중앙에 작은 접착제 방울을 부어 UV 경화 접착제의 얇은 층을 스핀 코팅합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 스핀 코팅 프로세스를 실행합니다. 스핀 코팅을 사용할 수 없는 경우 피펫을 사용하여 깨끗한 커버슬립에 약 0.1ml의 UV 경화 접착제를 떨어뜨립니다.
두 번째 커버슬립을 가져다가 첫 번째 커버슬립 위에 올려 액체 접착제가 두 커버슬립 사이에 고르게 퍼지도록 합니다. 접착제가 커버슬립의 가장자리에 도달하면 하나를 다른 위로 밀어 부드럽게 분리합니다. 분리되면 두 커버슬립은 얇은 액체 접착제 층으로 완전히 코팅됩니다.
스핀 코팅 후, UV에 노출시켜 접착제를 예비경화시킨다. 사용된 UV 소스의 출력 밀도에 따라 노출 시간을 조정합니다. 질감이있는 필름 중 하나를 가져 와서 접착제로 코팅 된 커버 슬립과 접촉시킵니다. 부분적으로 경화된 접착제와 질감이 있는 필름 사이의 접촉이 가능한 한 균일한지 확인하십시오.
이 단계에서 커버슬립의 접착제는 재유입을 방지할 수 있을 만큼 충분히 단단해야 하며 커버슬립을 부드럽게 눌러 접촉을 최적화할 수 있습니다. 코팅된 접착제층이 완전히 경화될 때까지 커버슬립을 자외선에 노출시킵니다. 이렇게 하면 커버슬립에 질감이 있는 필름이 밀봉되고 주변 구멍 사이에 누출 방지 격리가 제공됩니다.
그런 다음 핀셋을 사용하여 트리밍 후 여분의 재료가 남은 가장자리에 PDMS를 집어 PDMS 플랫 기판을 벗겨냅니다. 이 단계를 통해 질감이 있는 필름 층이 셀 파종을 위해 상단에 열린 접근이 있는 커버슬립에 부착될 수 있습니다. 세포 파종 전에, 원고에 기재된 바와 같이 생체 인식 공중합체로 부동태화된 장치 상에서, 멸균 PBS 1밀리리터를 35밀리미터 세포 배양 페트리 접시에 분배한다.
진공 챔버를 사용하여 멸균 PBS로 접시를 10분 동안 탈기한 다음, 모든 기포를 제거하기 위해 여러 차례의 피펫팅을 하였다. PBS를 멸균 배양 배지로 교체하고 세포 배양 후드 하에서 30분 동안 UV 광으로 플레이트를 멸균합니다. 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 관심 세포에 대한 트립신화 또는 세포 현탁액 제제 권장 사항에 따라 세포 현탁액을 준비한다.
권장 세포 배양 배지에서 밀리리터당 500, 000 세포로 세포 농도를 계산하고 조정합니다. 35mm 세포 배양 접시에서 PBS 완충액을 제거한 다음 조정된 세포 현탁액 1밀리리터를 분주합니다. 세포 배양 접시를 세포 배양기에 다시 10분 동안 넣습니다.
대략 80-100 개의 세포가 각 주변 공동으로 들어갑니다. 약 10분의 배양 후, 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 회수하고 세포 현탁액을 부드럽게 흡인하여 포획되지 않은 세포를 제거합니다. 배양 접시에 1 밀리리터의 배양 배지를 넣고 세포 배양기에 다시 넣습니다.
선택적으로 오가노이드가 웰에서 성장한 후 오가노이드를 회수하려면 핀셋을 사용하여 절단 가장자리의 질감 접착제 층을 꼬집고 유리 커버슬립에서 부드럽게 벗겨내되 매체에 담그십시오. 생체 공중합체의 농도를 증가시키면 코팅 두께가 증가하였다. 세포 배양 접시의 완전한 탈기는 주변 공동에 갇힌 기포를 제거하는 데 필수적이었습니다.
오가노이드는 배양 2일 및 15일 후에 형성되었다. 회전 디스크 컨포칼 현미경은 오가노이드의 대표 이미지와 3D 재구성을 보여주었습니다. 배양 접시를 준비할 때 금형 또는 기판 스택의 조립에 주의를 기울이고 질감이 있는 필름과 커버슬립 사이의 양호한 접촉을 보장하는 것이 중요합니다.
우리의 미세 공동이 제공하는 봉쇄와 물질 손실의 부재는 미세 중력이 유기체 항상성에 미치는 영향을 연구하는 데 관심이있는 우주 생물학 연구자들의 관심을 끌었습니다.
