형태 과학과 세포의 품질, 전분 과립 및 커널의 단백질 몸은 씨앗의 무게와 품질을 결정합니다. 이 연구에서는, 우리는 LR 백색 수지에 내장된 전체 커널의 간단한 인구로 제시하고 전체 커널의 간단한 건조 흡입 방법을 설정합니다. 우리는 두 가지 주요 이유로 내장 된 매체로 LR 화이트 수지선택합니다.
첫째, 점도와 강한 투과성으로, 특히 대량의 고분 함량이 있는 시리얼 성숙 커널을 위해 이 강력한 씨앗 섹션을 준비하는 데 좋은 응용 프로그램으로 이어집니다. 둘째, LR 백색 수지에 내장된 시료는 형광 현미경으로 빛 하에서 시료의 형태를 명확하게 나타내기 위해 많은 화학 염료로 쉽게 염색될 수 있다. 준비된 단면은 전체 커널의 출현시 세포, 전분 과립 및 단백질 바디를 명확하게 나타내기 위해 구체적으로 염색될 수 있고, 형태학적 매개변수도 정량적으로 분석될 수 있다.
이 방법에는 연구가 포함되어 있습니다. 여기서는 더 큰 볼륨과 높은 전분 함량을 가진 성숙한 옥수수 커널을 샘플로 사용하여 프로세스단계를 단계별로 전시합니다. 시작하려면 커널을 간단한 병에 넣습니다.
약 10밀리미터의 2.5%의 인산염 완충글루타랄데히드를 추가합니다. 한 번 더 pH 7.2를 배치하고 48 시간 동안 섭씨 4도에 배치하여 두 가지를 모두 수정합니다. 그런 다음 이 커널을 꺼내 2~3밀리미터 두께로 세로 또는 반경적으로 슬라이스합니다.
날카로운 양면 블레이드가 필요합니다. 그리고 또 다른 48 시간 동안 그들을 수정합니다. 다음으로, 샘플을 약 10mm로 세 번 세척하므로 0.1 M 인산염 버퍼, pH 7.2는 매번 30 분 동안 세척하십시오.
시료를 단계적으로 수화하려면 30분 동안 약 10mm의 30%에탄올 수성 용액에 담그고 10밀리미터로 연속적으로 담그면 50%70%90%,100%를 3회 흡수합니다. 시료 단계에 단계별로 침투하려면 10mm의 LR 화이트 수지 용액을 10mm의 LR 화이트 수지 용액으로 10밀리미터로 10밀리미터로 15%50%75%,12시간 동안 4도에서 100%로 연속적으로 회수합니다. 포함하기 전에 샘플을 위해 받침대를 준비해야합니다.
순수 LR 화이트 수지 250마이크로리터를 2mm 원심분리기 튜브에 넣고 48시간 동안 6도 의 섭씨로 중합합니다. 다음으로, 순수 LR 화이트 수지 500마이크로리터를 연속적으로 추가하고 샘플을 원심분리기 튜브에 받침대로 침투합니다. 해부학 바늘로 샘플을 곧게 한 후, 48 시간 동안 오븐에 섭씨 6도에 수지하십시오.
원심분리기 튜브에서 내장된 커널을 꺼내 날카로운 블레이드를 사용하여 샘플 주위의 과도한 수지를 잘라냅니다. 수지 블록을 마이크로톤 샘플 홀더에 놓고 시료 표면과 블레이드로 샘플 주위에 불필요한 수지를 잘라낸다. 완전한 단면이 형성될 때까지 유리 칼로 최종적으로 시료의 표면을 연마합니다.
이제 두 개의 미크론 두께로이 놀라운 섹션을 준비할 시간입니다. 슬라이스하기 전에 작은 구리를 블레이드 가장자리 에서 약 2 밀리미터 높이로 말하여 단면이 컬링되는 것을 방지하십시오. 단면도가 길게 지을 때, 그것을 지원하기 위해 섹션 아래에 스포크를 넣습니다.
다음으로, 프로비처되지 않은 슬라이드에 100 마이크로리터의 물을 추가하고 완전하고 깨지지 않은 부분을 치료자와 함께 물에 조심스럽게 옮길 수 있습니다. 50도에서 가열하여 건조하여 주름이 있는 부분을 부드럽게 합니다. 마지막으로 두 가지 중요한 팁에 주의가 필요합니다.
첫째, 단면도가 무너지거나 찢어지는 경우, 샘플의 각 수지 침투에 대한 시간을 연장한다. 둘째, 단면에 칼과 평행한 선이 있는 경우 샘플 블록을 단단히 고정합니다. 단면에 칼에 수직으로 된 선이 있는 경우, 새 칼을 사용해 주세요.
세포, 전분 과립 및 단백질 신체의 형태를 관찰하기 위해 형광 브라이트너 28, 요오드 용액 및 쿠마시 브릴리언트 블루 R250으로 섹션을 각각 얼룩지게 할 수 있습니다. 다른 특정 얼룩에 대 한, 제안 연구에 기초. 여기서는 요오드 솔루션을 사용하여 전분 과립을 염색하는 예입니다.
요오드 솔루션 40마이크로리터를 추가하여 단면을 몰입시다. 그리고 1 분 동안 항아리에 보관하십시오. 그런 다음 샘플을 커버 슬리브로 덮습니다.
그리고 그 주위에 초과 에이전트 솔루션을 블롯. CCTV 카메라가 장착된 조명 현미경 아래에서 즉시 샘플을 관찰하고 촬영합니다. 우리는 형태 분석 소프트웨어를 사용하여 커널에 대한 영역, 길거나 짧은 접근, 세포의 원도, 전분 과립 및 단백질 신체의 원도에 대한 촬영 된 이미지를 처리하고 정량적으로 분석 할 수 있습니다.
우리는 LR 화이트 수지에 전체 커널 크기의 섹션을 유지하기위한 간단한 건조 단면 방법을 설정합니다. 이 방법은 두 개의 미크론으로 전체 커널의 횡방향 및 세로 섹션을 준비할 수 있습니다. 또는 예, 오일 시드 강간의 성숙한 전체 씨앗은 횡방향과 세로로 단면 될 수 있습니다.
더 큰 볼륨옥수수의 성숙한 전체 커널의 섹션도 성공적으로 준비 될 수있다. 또한, 발전커널, 조리된 커널 및 발아커널도 방법을 이용하여 조사할 수 있다. 전체 커널의 준비된 섹션에는 아래 응용 프로그램이 있습니다.
첫째, 전체 커널의 단면도는 씨앗의 조직 구조를 관찰하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 사프란으로 얼룩진 오일시드 강간의 전체 배아의 단면은 명확하게 급진적 인, 하이퍼 캐주얼, 내부 및 외부의 나타낼 수 있습니다 전체 커널의 섹션은 관찰하고 세포의 형태를 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 오일시드 강간의 전체 배아의 트랜스버라클 부분은 형광 브라이트너(28)로 염색되고, 세포오일은 구체적으로 염색된다.
전체 배아의 모든 영역에서 세포의 미세 형태는 높은 배율로 표시 될 수있다. 빈약한 세포의 형태 매개 변수는 형태 분석 소프트웨어를 사용하여 정량적으로 분석할 수 있으며 배아의 다양한 영역에서 일부 차이를 보여줄 수 있다. 형광 브라이트너(28)로 염색된 옥수수의 전체 커널의 트랜스버럴 섹션은 또한 세포의 형태로서 전시할 수 있으며, 세포의 형태 매개변수는 내정자의 다양한 영역에서 상이하다.
전체 커널의 섹션은 전분 과립의 형태를 나타내기 위해 요오드 솔루션으로 염색 할 수 있습니다, 예를 들어, 요오드로 얼룩 옥수수 커널의 트랜스 버라저 및 세로 섹션은 명확하게 전분 과립의 형태를 나타낼 수 있습니다. 다양한 지역의 전분 과립은 내정자 세포에서 현저하게 다른 형태, 크기 및 양을 보여줍니다. 따라서 전분 과립의 형태학적 매개 변수에 대한 정량적 분석은 내정자를 위해 다양한 영역에서 상당히 다르다는 것을 보여줍니다.
단면도는 단백질 바디의 형태를 관찰하고 분석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 전분 단백질은 쿠마시 브릴리언트 블루 R250을 사용하여 파란색으로 염색됩니다. 유종유의 전체 배아에서 전분 단백질의 공간 분포는 낮은 배율에서 관찰될 수 있으며, 마이크로 구조는 높은 배율에서 명확하게 나타낼 수 있다.
또한, 선택된 지역에서 단백질 체의 숫자 오류 지수 및 형태학적 매개변수도 정량적으로 분석될 수 있다. 이 기술은 개발 및 성숙한 씨앗에서 전체 커널의 수지 섹션의 첫 번째 간단한 준비를 제공합니다. 전체 커널의 조직 구조에 있는 단면 응용 은 전체 커널의 다른 지구에 있는 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 형태에 조사합니다.
획득된 심상은 세포, 전분 과립 및 단백질 바디의 형태 학적 매개 변수를 보여주고 전체 커널의 다른 영역에서 더 비교하도록 정량적으로 분석 될 수 있습니다.
