Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정

이 프로토콜은 H5 고병원체 조류 인플루엔자 유사 바이러스 제제 및 유사 바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 고병원성 병원체는 3급 생물안전 실험실에서 수행해야 하는 반면, 유사 바이러스는 2단계 생물안전 실험실에서 안전하게 처리할 수 있습니다.

시작하려면 완전한 DMEM 배지에서 HEK293 FT 세포의 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 단세포 현탁액 10ml를 T75 플라스크에 첨가한 다음, 섭씨 37도에서 배양한다. 형질감염 2시간 전에 기존 배지를 클로로퀸이 포함된 10밀리리터의 신선한 완전 배지로 교체합니다.

원고에 설명된 대로 시약과 플라스미드 DNA를 혼합한 다음 이 혼합물을 세포 위의 배지로 옮기고 부드럽게 흔들어줍니다. 인큐베이션 후, 배지를 15 밀리리터의 신선한 완전 DMEM 배지로 교체한다. 65시간 후, 원심분리에 의해 상청액을 수확한다.

상청액을 수집하고 분취합니다. 헤마글루티닌 단백질 발현을 검출하기 위해, 50 마이크로리터의 PBS를 96 웰 둥근 바닥 플레이트의 컬럼 2 내지 12에 첨가한다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열의 우물에 첨가하십시오.

그런 다음 50 마이크로 리터의 유사 바이러스를 1 열에서 2 열의 우물로 옮깁니다. 컬럼 11까지 이 2배 희석을 수행한 후 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 컬럼 50에서 여분의 11마이크로리터를 버립니다.

0.5% 적혈구 50마이크로리터를 각 웰에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 30 내지 60 분의 배양 후, 슈도 바이러스의 헤마글루티닌 역가를 관찰하고 기록한다. 슈도바이러스 적정을 위해, 완전한 DMEM 배지에서 MDCK 세포의 밀리리터당 5배 내지 4번째 세포의 단일 세포 현탁액을 만든다.

1, 250, 2, 500, 5, 000, 10, 000, 20, 000 및 40, 000 세포를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 다른 웰에 추가합니다. 배양 후, 의사 바이러스를 해동하고 소용돌이. 96웰 원형 바닥판의 각 웰에 6개의 유사 바이러스 HAU를 추가하고 최대 120마이크로리터의 완전한 DMEM으로 각 웰을 보충합니다.

100 마이크로리터의 혼합물을 96 웰 플레이트 내의 세포로 옮긴다. 바이러스 감염을 위해 배양 플레이트를 48, 60 및 72시간 동안 배양하고 루시페라아제 분석을 수행합니다. 루시페라아제 분석을 수행하려면 배지를 조심스럽게 제거하고 200마이크로리터의 PBS로 헹구어 세포를 세척합니다.

가능한 한 많은 PBS를 제거한 다음 각 웰에 50 밀리리터의 용해 완충액을 추가합니다. 다음날, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 평형화시킨 다음, 배양 플레이트를 여러 번 흔들고 모든 세포 용해물을 불투명한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 각 플레이트에 50 마이크로 리터의 기판을 넣고 잘 섞는다.

광도계를 사용하여 유사 바이러스의 루시페라아제 역가를 기록합니다. MDCK 세포의 단일 세포 현탁액 100 마이크로리터를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 섭씨 37도에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 배양 후, 해동하고 소용돌이 치는 의사 바이러스와 혈청은 섭씨 영하 80도에서 보관됩니다.

완전한 배지에서 혈청을 20 배 희석하십시오. 100마이크로리터의 DMEM 배지를 컬럼 3-10에 추가합니다. 희석 된 혈청 200 마이크로 리터를 두 번째 컬럼의 웰에 넣고 연속 희석을 수행하십시오.

그런 다음 100마이크로리터의 DMEM 배지를 음성 대조군으로 11번째 열에 추가합니다. 100 마이크로 리터의 유사 바이러스를 각 웰에 넣고 혼합하십시오. 혼합물 100 마이크로리터를 96 웰 둥근 바닥 플레이트로부터 96 웰 세포 배양 플레이트의 상응하는 웰로 옮긴다.

섭씨 37도에서 60시간 배양한 후 루시페라아제 분석을 수행합니다. 헤마글루티닌 분석은 인플루엔자 유사 바이러스의 밀리리터당 643 HA 단위가 인플루엔자 유사 바이러스 스톡에 존재한다는 것을 보여주었다. HA와 Gag P24의 비율은 정상 범위 내에 있었다.

웨스턴 블롯 분석은 HA0, HA1, HA2 및 NA 단백질을 포함한 4가지 단백질 유형의 존재를 보여주었으며, 이는 인플루엔자 유사 바이러스와 야생형 바이러스의 유사성을 나타냅니다. 유사 바이러스 적정 결과는 가장 높은 상대적 루시페라아제 활성에 적합한 조건이 96 웰 플레이트의 웰에 5, 000개의 세포를 공급하고 바이러스 감염 60시간 후 상대적 루시페라아제 활성 판독값을 검출하는 것을 포함한다는 것을 나타냅니다. DDV 그룹의 면역 혈청은 슈도 바이러스 A 타이캔 104 균주에 대해 높은 중화 역가를 보인 반면, 대조군의 혈청은 중화 활성을 나타내지 않았습니다.

면역 혈청의 중화 활성은 대조군 혈청에 비해 강력했으며, 이는 많은 항체가 면역 혈청에서 HA 헤드로 향했음을 나타냅니다. 바이러스 진입 평가 동안 면역 혈청과 대조군 사이의 유의한 차이는 항체가 면역 혈청의 HA 줄기 영역으로 향한다는 것을 나타냅니다. 이 절차를 수행할 때 형질주입 용액과 배양 배지의 pH를 안정적으로 유지하는 것을 잊지 마십시오.