이것은 신생아 쥐에서 피질 척수관의 성공적인 공동 감염을 입증하는 최초의 프로토콜입니다. 어린 포유류에서 세포의 개별 하위 집단이 척수 손상으로부터의 회복에 어떻게 기여하는지 조사하기위한 정확한 청사진을 제공합니다. 다른 이중 바이러스 벡터 기술과 마찬가지로이 방법을 사용하면 사용자가 뉴런의 특정 하위 집단을 정확하게 형질 도입 할 수 있으므로 연구원은 회복을 촉진하는 다양한 화학 발생 기술의 효과를 확인할 수 있습니다.
우리는이 기술에 익숙하지 않은 연구자들이 적절한 척추 해부학을 찾는 데 어려움을 겪을 것으로 기대합니다. 따라서 척추 부분을 지속적으로 자주 계산하고 항상 랜드 마크를 다시 참조하는 것이 좋습니다. 신생아 Sprague Dawley 강아지의 마취 깊이를 확인한 후 두피 상단의 정중선에있는 집게를 눌러 절개 부위를 확인하고 시상 봉합사를 느낍니다.
깨끗하고 직선이며 정확한 절개를 위해 피부를 팽팽하게 잡고 I 라인 바로 위에서 시작하여 시상 봉합면을 따라 1cm 절개를하십시오. 다음으로, 두개골 표면을 따라 집게를 부드럽게 조사하고 봉합사와 정수리 및 정면 뼈를 따라 흐르는 집게로 인한 움푹 들어간 곳에주의를 기울여 브레그마를 식별하십시오. 관심 측면에 가중치 후크를 적용하여 개구부를 유지하십시오.
면봉과 마이크로 가위의 조합을 사용하여 동맥 경화증을 제거하여 브레그마의 노출을 최대화하여 정확도를 높입니다. 관상 봉합사가 후속 주사를 위한 대략적인 템플릿을 제공할 수 있을 만큼 충분히 측면으로 명확하게 보이는지 확인하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 브레그마 바로 옆에 있는 왼쪽 정면 두개골 뼈의 약 3x2mm 부분을 잘라냅니다.
면봉으로 파편, 뇌척수액 및 혈액을 제거하십시오. 바이러스를 주입하려면 바늘을 제자리에 놓고 분당 250나노리터의 속도로 1마이크로리터를 주입하도록 인젝터를 프로그래밍합니다. 주사가 끝나면 바늘을 피질에 3 분 동안 두십시오.
브레그마와 관련하여 피질을 따라 총 3 회 주사하기 위해 다른 좌표에서 주사를 반복하며 모두 0.6mm 깊이입니다. 주사를 마친 후 두피를 봉합하고 동물을 다른 수술대로 옮겨 자궁 경부 후궁 절제술을 시행합니다. 절개 부위를 식별하기 위해 손가락을 사용하여 두개골 바닥을 촉지합니다.
엄지와 검지로 장력을 가하여 피부를 팽팽하게 유지하십시오. 11번 칼날을 사용하여 두개골 기저부 뒤쪽 1-2mm 정중선에서 절개를 시작하고 절개 부위를 후방 1cm 연장하여 표재성 근육을 노출시킵니다. 칼날의 날카로운 부분을 사용하여 표면 근육의 정중선을 따라 일련의 절단을 부드럽게 만들어 척추강과 깊은 척추 근육을 노출시킵니다.
그런 다음 한 쌍의 집게를 사용하여 근육을 펴고 수술 창을 시각화하십시오. 깊은 척추 근육이 노출되면 견인기를 수술 창에 삽입하고 수술 창을 7-8mm 너비로 수축시켜 척추를 방해받지 않고 볼 수 있도록 합니다. 두 번째 경추는 등쪽으로 돌출되고 큰 돔 모양의 근육을 캡슐화하는 두드러진 가시돌기로 식별합니다.
뼈 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여 깊은 척추 근육을 옆으로 부드럽게 긁어 C3에서 C7 척추를 노출시킵니다. 내측에서 시작하여 척추 층과 평행 한 방향을 따라 옆으로 긁어 적절한 노출을 보장하여 척추 층을 명확하게 구별 할 수 있습니다. 면 끝으로 출혈을 조절하십시오.
척추 수준을 계산할 때 C2를 가이드로 사용하여 한 쌍의 마이크로 가위를 사용하여 C6 및 C7에서 연골 층의 측면 가장자리를 조심스럽게 자릅니다. 한 쌍의 미세한 집게를 사용하여 얇은 판의 해부 된 부분을 조심스럽게 제거하여 척수를 노출시켜 척추 창이 원하는 주사 부위를 수용 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인하십시오. 동물을 정위 두개골 홀더에 놓고 동물의 몸통 아래에 롤업 된 거즈 조각을 놓아 뒷부분을 높입니다.
주사를 시작하기 전에 면봉과 Sugi 삼각형을 해당 부위에 부드럽게 적용하여 척추 창에서 혈액이나 뇌척수액을 지우고 척수를 모욕하지 않도록주의하십시오. 또한, 지속적인 출혈 또는 CSF 누출에 의한 주사 부위의 폐색을 방지하기 위해 척추 창의 측면 부분에 작은 흡수성면 조각을 배치하여 창 둘레에 장벽을 만듭니다. 척수에 직접 주사하려면 유리 주사 바늘의 끝을 사용하여 척수 동맥을 식별하여 척수의 정중선을 근사화합니다.
다음으로, 바늘을 C5 층 바로 뒤쪽의 대략적인 정중선에 놓고 이것을 기준점으로 사용하십시오. 그런 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 오른쪽으로 0.3mm 옆으로 이동하고 척수 표면에 닿을 때까지 바늘을 내립니다. 이 깊이에서 바늘을 뛰어 넘으십시오.
척수 속으로 0.6 밀리미터. Cre 재조합 효소 유전자를 운반하는 레트로 아데노 관련 바이러스 2 마이크로리터를 분당 250 나노리터로 1 마이크로리터 주입한다. 그런 다음 바이러스가 척수로 확산 될 때까지 2 분 동안 기다렸다가 바늘을 천천히 빼냅니다.
Cre 의존성 DREADDs mCherry를 발현하는 뇌 관상 절편의 운동 피질에있는 5 층 피질 척수 관 뉴런의 표지와 retro Cre의 반대쪽 척추 주입이 여기에 표시됩니다. 특정 뉴런 집단을 표적으로 삼을 수 있으면 회복을 유도하는 뉘앙스를 묘사하고 발달 중인 신경계의 근본적인 척수 손상을 치료하는 데 더 많은 정확도를 제공하는 데 도움이 됩니다. 이 방법은 어린 쥐의 척수 손상을 치료하기위한 수단으로 흥분성 DREADD를 사용하는 실행 가능성을 조사 할 수있는 길을 열었습니다.
