이 프로토콜은 공생 박테리아에 유전 조작을 수행하는 데 유용, 이 경우, 특히 Burkholderia에, 곤충 호스트를 식민지에 필수적인 유전자를 식별. 트랜스포슨 삽입 시퀀싱은 단일 실험에서 많은 수의 조건부 필수 유전자를 동시에 식별하기 위한 강력한 도구입니다. 멸균 후드 아래 카나마이신과 DAP로 보충된 LB 배지의 10밀리리터에서 E.coli 기증자의 신선한 기증자 문화를 접종하는 것으로 시작하십시오.
KB 배지의 5밀리리터에서 C수신자 세포를 접종한 버크홀더리아 검투사. 250 RPM에서 셰이커에 하룻밤 30도에서 문화를 배양. 하룻밤 성장 후, 원심분리기 는 세포를 펠릿하고 상체를 폐기하기 위해 6 분 동안 9, 600 회 G에서 각 배양의 4 밀리리터를 제거합니다.
멸균 후드 아래에서, DAP를 포함하는 KB 배지에서 펠렛 세포 배양을 세척한다. 그리고 마지막으로, KB 플러스 DAP 매체의 4 밀리리터에서 별도로 문화를 다시 중단합니다. 신선한 15 밀리리터 튜브에서 세척된 대장균 기증자 세포의 250마이크로리터를 세척된 버크홀더리아 검투사 균주 A 수취인 세포의 1밀리리터와 혼합합니다.
DAP를 함유한 KB 천판에 이 컨쥬게이션 셀 혼합물의 10마이크로리터를 반점한다. 접시가 실온에서 멸균 후드에 방해받지 않고 1 시간 동안 쉬도록 하십시오. 12~18시간 동안 30도의 연상 반점으로 플레이트를 배양합니다.
인큐베이션 후, 멸균 후드 아래 플레이트에 1X PBS의 2~4밀리리터를 추가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 한천에서 재배된 세균 성 균류 반점을 방출합니다. 그런 다음 두 밀리리터 마이크로 퍼지 튜브로 컨쥬게이트 셀 믹스를 피펫. 2 분 동안 9, 600 배 G에서 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
상체를 버리고 1X PBS의 1 밀리리터에서 위아래로 파이프를 통해 펠릿을 두 번 씻으십시오. 1X PBS의 1, 200 마이크로리터에서 최종 펠릿을 다시 중단합니다. 잘 섞어서 카나마이신으로 보충된 대형 KB 식천 판에 셀 혼합물 100마이크로리터를 넣고 하룻밤 사이에 섭씨 30도에서 배양합니다.
세 개의 플레이트에 있는 트랜스콩트 식민지의 총 수를 계산하고 모든 판에서 얻은 돌연변이의 대략적인 수를 계산하기 위하여 추정합니다. 대표적인 도서관을 획득할 확률을 높이기 위해 총 식민지 수가 게놈의 총 유전자 수보다 몇 배 더 높은지 확인합니다. 컨쥬게이션의 성공을 확인하기 위해 원고에 설명된 바와 같이 10~20개의 샘플 콜로니를 사용하여 삽입 카세트를 대상으로 PCR을 수행한다.
멸균 후드 아래에서 한천에 1~2밀리리터를 추가하여 접시에서 콜로니를 긁어냅니다. 접시에서 긁어낸 셀 혼합물을 50 밀리리터 튜브로 풀을 냅니다. 라이브러리를 철저히 혼합한 다음 풀링된 돌연변이 라이브러리의 밀리리터 1밀리리터를 여러 개의 저저온 튜브로 분할합니다.
튜브에 70%의 글리세롤 1밀리리터를 넣고 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. L.villosa 계란 클러치를 선택하고 클러치에 100 개 이상의 달걀이 들어있는 경우 계속 계란의 수를 계산합니다. 계란 클러치 전체를 소독하려면 70%에탄올200 마이크로리터를 넣고 달걀을 5분간 부드럽게 씻은 다음 에탄올을 제거하고 자동 물로 계란을 두 번 씻습니다.
표백제 12%의 마이크로리터 200기를 넣고 달걀을 30초 동안 부드럽게 씻습니다. 표백제를 즉시 제거하고 200 마이크로리터의 오토클레이터로 다시 세 번 씻어내십시오. PBS에 있는 세척된 돌연변이 도서관의 마이크로리터 당 6개의 세포에 2회 10을 사용하여 멸균된 계란 클러치에 있는 계란을 감염시.
감염된 딱정벌레 애벌레 해치 후 이틀 후, 1.5 밀리리터 미세 후지 튜브 당 100 초 인스타 애벌레를 수집하고 영하 80도에서 저장합니다. 체외제어 라이브러리를 생성하기 위해, 가나마이신을 함유한 KB 배지의 10밀리리터에서 돌연변이 라이브러리의 마이크로리터 당 6개의 세포에 2회 10의 마이크로리터를 접종한다. 생체 내 및 체외에서 성장한 돌연변이 라이브러리에서 DNA를 추출한 후 초음파 검사기와 DNA를 공유하십시오.
DNA가 원하는 크기 범위로 전염되었는지 확인하기 위해 젤 로딩 염료와 혼합한 후 40분 동안 250볼트에서 250볼트로 실행되는 1.6%의 아가로즈 젤을 사용하여 미세어드 및 시어드 DNA의 5마이크로리터를 적재한다. 어댑터 결찰에 필요한 단편 단자를 준비하려면, 효소 혼합물의 3개의 마이크로리터와 7개의 반응 완충제의 마이크로리터를 시어드 DNA의 50마이크로리터에 추가하고 파이펫팅하여 잘 섞는다. 가열 된 뚜껑이 섭씨 75도 보다 크거나 같으면 서열 자전거를 설정하고 섭씨 20도에서 30 분, 섭씨 65도에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션한 다음 섭씨 4도에서 온도를 유지하십시오.
어댑터 리딩의 경우, 결찰 마스터 믹스 30마이크로리터, 결찰 증강제 1편, 희석어 2.5마이크로리터를 최종 준비 단계의 제품에 추가합니다. 피펫팅으로 철저히 섞고 가열된 뚜껑을 끄고 온도 순환기의 섭씨 20도에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 15분 후 효소의 마이크로리터 3기를 추가합니다.
피펫팅으로 잘 섞고 온도 47도 이상으로 가열된 뚜껑을 열주기에서 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 250개의 베이스 쌍의 어댑터 리그 DNA 표적화 단편의 크기를 선택하려면 마그네틱 비드 용액을 소용돌이로 시작하여 사용하기 30분 전에 실온에 놓습니다. 구슬의 0.3 배를 합착 된 DNA 혼합물의 96.5 마이크로 리터에 넣고 완전히 파이펫팅하여 혼합하십시오.
비드 혼합물을 5분간 배양합니다. 튜브를 자기 스탠드에 놓고 구슬을 내리고 원치 않는 크기의 DNA 조각을 제거합니다. 구슬을 5분 동안 정착한 다음 명확한 상체를 새로운 미세분리기 튜브로 옮기게 합니다.
상체에 신선한 구슬의 0.15 배를 추가하고 잘 파이펫으로 혼합. 비드 혼합물을 5분 동안 배양한 다음 자기 스탠드에 튜브를 배치하여 대상 DNA에 묶인 구슬을 끌어당깁니다. 5분 간 기다린 다음, 상수구를 버리고 구슬을 보관합니다.
마그네틱 스탠드에 구슬을 장착하면 갓 준비된 80%에탄올 200마이크로리터를 넣고 30초 동안 기다렸다가 비슬을 방해하지 않고 에탄올을 폐기합니다. 스탠드에서 튜브를 제거하고 0.1X TE 또는 Low TE의 17 마이크로 리터를 추가 한 다음 10 번 파이프팅하여 혼합하고 실온에서 2 분 동안 혼합물을 배양합니다. 자기 스탠드에 튜브를 놓고 PCR-1에 대한 크기 선택 된 DNA의 15 마이크로 리터를 가져 가라.
소용돌이 연쇄상 구슬을 실온에 30 분 이상 배치하십시오. 구슬 32 마이크로리터를 1X 결합 및 세척 버퍼 500 마이크로리터로 세척하십시오. 2X 바인딩 및 세척 버퍼의 32 마이크로 리터를 추가하고 구슬을 다시 중단합니다.
이를 위해, 청소 PCR-1 제품의 32 마이크로 리터를 추가합니다. 철저히 섞어서 실온에서 30분간 배양하세요. 비드 DNA 혼합물을 자기 스탠드에 2분간 놓습니다.
삽입 가장자리를 포함하는 비오틴 태그 DNA로 피펫은 구슬에 스트렙타비딘에 결합합니다. 1X 결합 및 세척 버퍼의 500 마이크로 리터로 구슬을 씻은 다음 낮은 TE의 200 마이크로 리터로 구슬을 씻으신다. 낮은 TE의 17 마이크로 리터에서 DNA 바인딩 구슬을 다시 중단. 생체 내 및 체외 에서 재배된 돌연변이 라이브러리의 DNA는 초음파에서 추출및 단편화되어 100에서 400개의 기본 쌍 사이의 조각의 대부분을 보여주었습니다. 버크홀더리아 검투사 균주의 4개의 레플리턴을 가로지르는 트랜스포슨 매개 삽입의 위치는 포드에서 관찰될 수 있다.
시퀀싱 출력및 생체 내 라이브러리에서 복제된 세 개의 복제에서 명중된 독특한 삽입 및 유전자의 수에 대한 요약은 테이블에서 관찰될 수 있다. 기억해야 할 중요한 것은 감염 시 라이브러리를 적절하게 표현하기 위해 호스트 식민지 화 시 인구 병목 현상 크기를 계산하는 것입니다. 또한, 시험관 내 및 숙주에서 호환되는 수의 세균 성 세대에 맞게 조정하십시오.
트랜스포슨 돌연변이 라이브러리를 생성한 후, 선택적 매체에서 선별된 미디어를 스크리닝하여 현상차이에 기초하여 돌연변이를 복구할 수 있다. 조건에 중요한 특정 유전자는 이렇게 확인될 수 있습니다.
