이 방법은 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 내분비학. 그리고 다낭성 난소 증후군 또는 PCOS 및 hyperandrogenism의 연구에 적용 할 수 있습니다.
이 기술의 장점은 비용이 많이 드는 효과적인 방법으로 호르몬의 일관된, 균일한, 장기 방출을 용이하게한다는 것입니다. 절차를 치료하는 JHUs는 내 실험실에서 기술자 인 Ping Xue가 될 것입니다. 디하이드로테스토스테론 또는 DHT 펠릿 준비를 위해 면도날을 사용하여 15mm 크기의 실리콘 튜브를 자른다.
또한 무딘 20 게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기를 사용하여 2~5밀리미터의 의료용 접착제 실리콘을 튜브의 한쪽 끝에 주입합니다. 하룻밤 사이에 튜브를 건조시키십시오. 그리고 밀봉 된 끝에 기포를 확인합니다.
적절한 개인 보호 장비를 착용하면 흐름이 플라스틱 웨이보트에 DHT 분말을 붓습니다. 접착제 캡 튜브의 열린 끝을 파우더에 감동. 큰 스트레이트 페이퍼 클립을 사용하여, DHT가 적절한 실험 깊이에 도달 할 때까지, 튜브에 분말을 탬핑.
그런 다음 하룻밤 동안 실리콘으로 튜브의 열린 측면을 밀봉합니다. 다음 날 아침, DHT양쪽에 2밀리미터 길이의 실리콘을 얻기 위해 밀봉된 측면을 잘라내고 DHT 제어 펠릿을 분리하지 않았다. 그런 다음 펠릿을 실온에서 호일로 감싸는 50 밀리리터 원내 튜브에 최대 3개월 동안 보관하십시오.
PCOS 마우스 모델 생성의 경우 최대 20개의 DHT 또는 대조군 펠릿을 별도의 50밀리리터 원물 튜브에 함유하고 있으며 37°C에서 24시간 동안 0.9% 식염수의 30밀리리터를 함유하고 있습니다. 다음 날, 마취 된 2 개월 된 여성 마우스에서 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인하고 순차적 포비도네 요오드및 70 % 에티놀 스크럽을 수술 부위에 투여하기 위해 멸균 거즈를 사용합니다. 다음으로 목 근처의 피부를 통해 5밀리미터 절개를 합니다.
그리고 10 게이지 트로카를 사용하여 장밋빛 방향으로 15mm 터널을 만듭니다. 트로카를 사용하여 펠릿을 터널에 삽입하고 수술 접착제로 절개를 밀봉하십시오. 손동포면으로 상처 가장자리를 수동으로 근사화하고 부드러운 칫솔질 스트로크를 사용하여 상대상처 가장자리의 각 면에서 1센티미터 떨어진 액체 접착제의 세 개의 박막 층을 적용합니다.
그런 다음 마우스를 열 패드에 케이지에 혼자 두면 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링합니다. 안드로겐 노출의 일정한 수준을 유지하기 위해 4 주마다 펠릿을 교체. 펠릿 삽입 3일 후, p10 파이펫을 사용하여 멸균 식염수 10마이크로리터를 질 구멍에 분출하고 파이펫 팁을 사용하여 식염수를 즉시 회수합니다.
질 세포 식염수 샘플을 표지된 슬라이드에 퍼감습니다. 그리고 식염수들이 실온에서 건조하도록 합니다. 말린 슬라이드를 100% 에티놀의 용기에 5분 이상 고정합니다.
그런 다음 슬라이드를 버퍼 B로 1분 동안 염색하고 DIF 빠른 염색 키트에서 C를 버퍼링합니다. 완충C인큐베이션의 끝에서 는 슬라이드를 수돗물로 3초 동안 세척하고 실온에서 건조시다. 경현미경의 10배 목표 하에서 슬라이드를 볼 수 있는 에스스트러스 사이클리시티를 결정한다.
각 단계의 일수를 계산하고 각 단계에서 백분율 시간을 계산하기 위해 총 일수로 나눕니다. 포도당 내성을 테스트하기 위해, 20 일 DHT 삽입, 하룻밤 마우스를 빨리. 다음 아침 마우스의 무게를 측정하고, 꼬리 정맥 혈액의 바질 포도당 수준을 측정하기 위해 글루코프터와 테스트 스트립을 사용합니다.
20%의 덱스트로스트로즈의 킬로그램 당 2 그램의 마우스를 주입하십시오. 그런 다음 15, 30, 60, 90, 120 분 후 덱스트로스 투여에서 꼬리 정맥 혈액 샘플의 포도당 수준을 측정합니다. DHT 삽입 된 여자에서 여성 자손을 취득하려면, 펠릿 삽입 다음 15 일에 입증 된 비옥한 남성과 케이지에서 테스트하는 여성 마우스를 이동합니다.
마우스가 임신여부를 결정하기 위해 매주 여성의 체중을 문서화합니다. 산후 7일째에, 랜싯 팁을 문신 페이스트에 담그고 발가락에 문신으로 각 새끼를 표시하십시오. 70일까지 7일마다 표시된 마우스의 무게를 측정합니다.
산후 날짜 12에서 16 사이, 귀는 그림에 도시된 바와 같이 시스템에 따라 그(것)들을 번호하는 마우스를 펀치합니다. 성별을 구별하려면 태그가 지정된 각 마우스의 복부 면을 검사합니다. 암컷은 눈에 보이는 젖꼭지를 가질 것입니다.
다양한 다운스트림 분석을 위한 혈액 샘플을 수집하기 위하여는 하부 정맥 출혈에 의해 9와 10 am 사이 혈액의 대략적인 실험적인 양을 수집하는 랜싯을 이용합니다. 그리고 세럼 수집을 허용하기 위해 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음 혈청 샘플을 분석 할 때까지 섭씨 영하 80도에서 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 저장합니다.
DHT 여성 자손의 사춘기를 평가하기 위해, 산후 21일에 짜낸 후 매일, 육안 검사에 의하여 질 개구부를 확인하십시오. 그리고 구경을 사용하여 아노 생식기 거리를 측정하십시오. 혈청 DHT의 절대 값은 질량 분석과 엘리사 분석 사이에 다르지만 DHT대 DHT 삽입의 상대적 포크 변화는 분석과 실험 전반에 걸쳐 유사합니다.
DHT 수준은 DHT와 노 DHT 마우스 모두에서 임신을 통해 임신전에서 크게 증가한다. 그러나, DHT 수준은 전 개념화 및 임신 시간 지점에서 DHT 마우스가 없는 것과 비교하여 DHT 마우스에서 2배 더 높습니다. 성인 DHT 딸은 생식 기능에 있는 다름을 전시합니다.
예를 들어, 자궁 에서 상당히 긴 시간을 경험 하는 성인 NO DHT 딸에 비해 심 즙이 많은 사이클리시티를 중단 하 고 프로 에스테우스와 에스테르에서 더 적은 시간. 이 절차를 시도하는 동안 그들은 호르몬의 균일 한 방출에 사용 되기 전에 24 시간 동안 펠 릿을 배양 하는 것을 기억 하는 것이 중요 하다. 이 절차에 따라, DHT 노출의 생식 및 신진 대사 결과 또한 검사될 수 있습니다.
그것은 개발 후, 이 기술 PCOS와 여성 마우스에 낮은 수준의 hyperandrogenism의 영향을 공부 하는 엔로크로노학 및 모계 태아 상호 작용의 분야에서 연구원에 대 한 길을 포장. DHT와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 장갑과 마스크및 고글을 착용하고 바이오 안전 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치는 항상 이 절차를 수행하는 동안 취해야 합니다.
