우리의 오가노이드 모델은 항상성뿐만 아니라 신생아의 신생아 성숙, 노화 관련 기능 감소 및 땀샘의 종양 성장과 같은 뇌하수체 리모델링 조건에서의 뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하는 데 매우 중요합니다. 현재까지 우리의 뇌하수체 오가노이드 기술은 일차 마우스 뇌하수체 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Emma Laporte와 Charlotte Nys, 내 연구 그룹의 박사 과정 학생들입니다.
시작하려면 마우스 머리를 탈 이온수로 씻어 혈액을 제거하십시오. 머리에 70 % 에탄올을 뿌려 멸균 환경을 조성하십시오. 그런 다음 멸균 수술 도구를 사용하여 귀 사이의 피부를 제거하십시오.
두개골을 열려면 멸균 된 가위로 코 다리를 부러 뜨립니다. 코 다리에서 시작하여 양쪽의 귀쪽으로 두개골을 더 엽니 다. 뇌하수체를 만지지 않고 멸균 핀셋으로 두개골과 뇌를 제거하십시오.
무딘 핀셋으로 다이어프마 셀레를 제거하십시오. 그런 다음 입체 현미경으로 전엽을 후엽 및 중간 엽에서 분리하십시오. 둔한 핀셋으로 전엽을 조심스럽게 분리하고 3 밀리리터의 중간 A.Prewarmed 2.5 % 트립신 용액 2 밀리리터가 들어있는 10 밀리리터 삼각 플라스크에 수집하십시오.
섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 미리 예열 된 DNAse 용액 두 밀리리터를 넣고 삼각 플라스크를 10 번 소용돌이 치십시오. 뇌하수체가 바닥에 가라 앉게하고 상층액을 제거하십시오.
미리 가온된 트립신 억제제 용액 두 밀리리터를 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양한다. 뇌하수체가 바닥에 가라 앉을 때 상층액을 제거하십시오. 미리 예열 된 배지 B 두 밀리리터를 넣고 다섯 분 동안 배양하십시오.
여기에 미리 예열 된 배지 C 두 밀리리터를 넣고 15 분 동안 배양하십시오. 뇌하수체가 바닥에 가라 앉게하고 상층액을 제거하십시오. 그런 다음 미리 데운 배지 C.Aspirate로 세 번 헹구고 미리 데운 배지 C.Aspirate의 두 밀리리터를 추가하고 조각이 더 이상 보이지 않을 때까지 멸균되고 화염으로 연마 된 파스퇴르 피펫으로 뇌하수체를 여러 번 배출하십시오.
현탁액을 4.5 밀리리터의 미리 예열된 DNAse 용액이 들어있는 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 미리 예열 된 배지 C 두 밀리리터로 플라스크를 세 번 헹구고 현탁액을 튜브로 옮깁니다. 수집된 세포 현탁액을 혼합하고 40미크론 세포 스트레이너를 통해 30밀리리터 튜브로 여과한다.
튜브와 세포 스트레이너를 두 밀리리터의 배지 C로 세 번 헹구고 현탁액을 튜브로 옮깁니다. 유리 파스퇴르 피펫을 두 밀리리터의 BSA로 채 웁니다. 피펫의 끝을 튜브 바닥에 놓고 부드럽게 피펫을 꺼내 가시 밀도 층을 형성하십시오.
섭씨 네 도에서 10분 동안 190배 G에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F-12 1밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 세포 카운터로 세포를 정량화하십시오.
세포 현탁액을 섭씨 네 도에서 10분 동안 190배 G에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 세포 펠릿을 고급 DMEM/F-12에 재현탁하여 밀리리터당 1.1배 10~6번째 셀의 셀 밀도에 도달합니다. ECM을 30:70의 비율로 원하는 부피의 세포 현탁액에 첨가하고 잘 섞는다.
이 혼합물의 30 마이크로 리터 방울을 미리 데운 48 웰 플레이트의 각 웰에 증착하십시오. 플레이트를 거꾸로 돌리고 ECM을 섭씨 37도에서 20 분 동안 응고시킵니다. 인큐베이션 후, 10-마이크로몰 ROCK 억제제로 보충된 250 마이크로리터의 미리 가온된 뇌하수체 오가노이드 배지를 조심스럽게 첨가한다.
2 내지 삼일마다 오가노이드가 완전히 성장할 때까지 10 내지 14일 동안 ROCK 억제제가 없는 배지를 변경한다. 오가노이드를 통과하려면 먼저 배지를 부드럽게 흡인하고 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM / F-12를 첨가하여 ECM을 분해하십시오. 이어서, 오가노이드를 마이크로원심분리 튜브에 수집한다.
400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM / F-12로 우물을 씻으십시오. 튜브를 섭씨 네 도에서 다섯 분 동안 200배 G에서 원심분리한다. 상청액을 제거하고 미리 가온된 TrypLE Express 효소 400 마이크로리터를 첨가한다.
튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양하십시오. 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM / F-12를 추가하십시오. 섭씨 네 도에서 5분 동안 200배 G에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다.
펠렛을 100 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM/F-12로 재현탁하십시오. P-200 팁을 좁히고 팁을 사용하여 오가노이드 단편이 얻어질 때까지 격렬하게 피펫팅하여 오가노이드를 해리시킵니다. 800 마이크로 리터의 고급 DMEM / F-12를 추가하십시오.
섭씨 네 도에서 10분 동안 190배 G에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 오가노이드를 통과하려면 펠렛을 적절한 부피의 고급 DMEM / F-12에 재현탁하고 ECM을 30:70의 비율로 첨가하십시오. 잘 섞는다.
텍스트 원고에 설명 된대로 오가노이드를 계속 시드하고 배양하십시오. 전엽으로부터 해리된 단일 세포를 ECM에 시딩하고 뇌하수체 오가노이드 배지에서 성장시켰다. 시딩 후 14 일 후, 오가노이드가 완전히 발달되어 최대 500 마이크로 미터의 직경에 도달했습니다.
이 단계에서, 오가노이드는 내강을 둘러싸고있는 상피층이있는 낭성 형태를 나타내었다. 성장 후 조밀 한 구조가 나타나는 우물을 사용하지 않는 것이 좋습니다. 계대배양을 위해, 오가노이드 단편을 시딩에 사용하였다.
통과 후 칠일 후, 유리한 오가노이드 재성장이 낭성 구조로 관찰되었다. 조밀 한 오가노이드는 바람직하지 않은 오가노이드가 문화를 장악 할 수 있으므로 폐기해야합니다. 상피 마커 E-cadherin 및 사이토케라틴 8 및 18에 대한 면역형광 염색 분석을 통해 오가노이드의 상피 특성을 확인하였다.
뇌하수체 줄기 세포 마커 Sox2 및 Trop2의 발현은 줄기를 입증하였고, 뇌하수체 특이적 마커 LHX3는 오가노이드의 뇌하수체 표현형을 나타내었다. 마커 Ki67의 발현은 오가노이드를 구성하는 세포가 증식성 상태에 있음을 보여주었다. RTQ PCR 분석은 다중 계대 후에도 전엽에서보다 오가노이드에서 줄기 마커의 발현이 더 높은 것으로 나타났으며, 이는 줄기 세포의 농축을 검증하였다.
초기 시딩시 ECM 돔에 적절한 수의 단일 세포를 플레이트하는 것이 중요하며, 오가노이드를 통과 할 때 단일 세포가 아닌 단편을 다시 시드하는 것을 기억해야합니다.
