Organoids는 약물 선별 및 생물학적 과정을 이해하는 데 사용되는 강력한 체외 기술입니다. 따라서 혀를 모델링하는 오르가노이드를 생성하는 것은 맛 세포 발달과 재생을 연구하는 데 매우 중요합니다. 전통적인 생체 내 맛 연구는 비싸고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.
이 organoid 프로토콜은 더 높은 처리량 실험을 허용하면서 이러한 문제를 최소화하는 표준화되고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 성인 마우스를 안락사 한 후, 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러 뜨리세요. 그런 다음 혀를 들어 올리고 언어 프레이틀럼을 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다.
혀를 잘라 칼슘과 마그네슘으로 멸균 얼음 차가운 dPBS로 수집합니다. 해부 현미경으로, 면도날로 인터 말라지 의 앞쪽을 절단하여 전방 혀를 제거하고 버립니다. 그런 다음 섬세한 작업 와이프를 사용하여 후방 혀에서 머리카락과 과도한 액체를 제거합니다.
다음으로, 1 밀리리터 주사기를 200~300마이크로리터의 주사 효소 용액으로 채우고, 주위 유두 또는 CVP의 전방까지 인터 말라저 에지우닝 바로 위에 30 게이지 반인치 바늘을 삽입한다. 상피와 기본 조직 사이의 CVP의 측면 가장자리 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입하십시오. 용액이 주입됨에 따라 주사기를 혀에서 천천히 그리고 지속적으로 철회하십시오.
혀와 멸균 칼슘 마그네슘이 없는 dPBS를 실온에서 33분 간 배양합니다. 초미세 해부 가위를 사용하여, CVP의 양측 과 단지 전방에 작은 상처를. 그런 다음 미세 한 집게로 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다.
트렌치 상피가 기본 결합 조직이 없는 후 FBS로 미리 코팅된 2밀리리터 미세 원심 분리튜브에 넣습니다. 해리 효소 칵테일을 껍질을 벗긴 CVP 상피를 포함하는 튜브에 넣고 15분마다 짧은 소용돌이로 45분 동안 섭씨 37도의 수조에 배양합니다. 마지막 15분 동안 수조에서 0.25%의 트립신-EDTA를 예식합니다.
인큐베이션을 따라 1분 동안 유리 파스퇴르 파이펫으로 세트리어트튜브를 소용돌이시다. 조직 조각이 정착 한 후, 새로운 FBS 코팅 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 해리 된 세포의 첫 번째 컬렉션을 포함하는 상피. 370회 G와 섭씨 4도에서 5분간 상체를 회전하여 세포를 펠릿합니다.
결과 상체를 제거한 다음 FACS 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단하고 얼음 위에 보관하십시오. 원래 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 남아있는 조직 조각을 분리하려면, 사전 따뜻하게 0.25 %의 Trypsin-EDTA를 추가하고 10 분마다 짧은 소용돌이와 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 유리 파스퇴르 파이펫으로 티슈 조각을 1 분 동안 세리라뜨 살릴 수 있습니다.
조직 조각이 정착한 후, FACS 버퍼에서 이전에 수집된 해리 세포를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브내로 상피한다. 분리된 셀로 튜브를 회전시합니다. 상체를 제거 한 후 FACS 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 보관하십시오.
이어서, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 FACS를 통해 LGr5-GFP 양성 세포를 분리한다. 원하는 수의 Lgr5 양성 부유 세포를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 370회 G와 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 회전하여 세포를 펠릿합니다.
상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 부드러운 파이펫팅으로 적절한 양의 매트릭스 젤로 셀 펠릿을 부드럽게 재페펜팅합니다. 그런 다음 50 밀리리터 원판 튜브에 미세 원심 분리기 튜브를 얼음에 보관하여 매트릭스 젤이 겔화되는 것을 방지합니다.
48웰 플레이트의 각 웰의 중앙에 있는 세포 혼합물에 매트릭스 젤의 15 마이크로리터를 추가합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 3개의 우물마다 도금 후 위아래로 파이프를 사용하여 매트릭스 젤과 셀 혼합물을 섞습니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%를 10분간 넣어 매트릭스 젤의 겔화를 허용합니다.
이어서, 300 마이크로리터의 실온 WENRAS 미디어를 암석 억제제Y27632로 보충하여 각 우물에 넣고 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 도금 후 이틀 후, 1밀리리터 파이펫을 사용하거나 진공 포부를 통해 각 우물에서 미디어를 제거하여 조건 간의 교차 오염을 보장합니다. 300 마이크로리터의 WENRAS 미디어를 우물 의 측면에 추가하여 매트릭스 젤을 방해하지 않도록주의하고 접시를 인큐베이터에 반환하십시오.
언어 오르가노이드가 WENR 미디어를 사용하여 배양될 때, 그들은 효율적으로 성장하지 않습니다. 그러나, A 83-01, TGF-베타 시그널링 억제제 및 SB202190, P-38 맵 키나아제 신호 억제제, 견고한 성장을 추가한 후, 견고한 성장이 관찰된다. 흥미롭게도, 6일 후에 매체에서 이러한 억제제들을 제거하면 일반적인 맛 수용체 세포 마커인 Kcnq1의 더 높은 발현이 발생하며, 이는 A 83-01 및 SB-202190이 맛 세포 분화를 방해한다는 것을 시사한다.
따라서, 최적의 성장 및 분화는 WENRAS 미디어에서 오르가노이드를 0일에서 6일째까지 배양하고 WENR 미디어를 6일째부터 12일째까지 배양하여 얻을 수 있다. 성숙한 오르가노이드는 각질-8에 의해 표시된 맛 세포와 각질-13에 의해 표시된 비 맛 상피 세포를 모두 포함합니다. 또한, 케라틴-13은 모든 3개의 맛 수용체 세포 마커보다 더 높은 수준으로 표현되며, 이는 오르가노이드가 주로 비맛 상피 세포로 구성된다는 것을 시사한다.
오르가노이드는 모든 맛 수용체 세포 유형을 표현합니다. Entpd2와 Gnat3에 의해 표시된 쓴 타입 2 세포에 의해 표시된 타입 1 세포는 맛 오르가노이드에서 높게 표현되고, Car4에 의해 표시된 신 감지 타입 3 세포는 보다 적게 일반적이다. 미각 수용체 세포는 생체 내에서 관찰되는 이산 미각 구조보다는 오르가노이드에 무작위로 분포된다.
구강에서 혀를 해부 할 때 CVP에 일부 조직 후방을 포함해야합니다. 또한, 두 참호가 튀어 나와 상피를 벗길 때 얻어졌는지 확인하십시오.
