이 새로운 인간 치아 유래 오가노이드 모델은 치아 재생 응용 분야에 대한 관점으로 인간 치과 줄기 세포 생물학을 해독하는 최초의 강력한 도구를 제공합니다. 현재이 치아 오가노이드 모델은 인간 치아 상피 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 이 오가노이드 프로토콜은 건강뿐만 아니라 치과 종양 및 박테리아 영향과 같은 병든 치아에서도 연구 모델을 수립하는 데 적용될 수 있습니다.
이러한 질병 모델의 탐구는 새로운 치료 목표를 발견 할 수 있습니다. 이 오가노이드 모델은 인간의 치아에서 에나멜 형성 과정을 해독하는 데 매우 중요하며 생성 목적으로 에나멜과 같은 치아 부분을 구성 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구 그룹의 박사 과정 학생 인 Lara Hemeryck이 될 것입니다.
시작하려면 얼음 위에 놓인 수집 매체에서 관련 치과 모낭이있는 세 번째 어금니를 수집하고 튜브의 내용물을 Petri 접시로 옮깁니다. 핀셋으로 치아를 잡고 수술 블레이드를 사용하여 치아 모낭을 조심스럽게 분리하십시오. 치과용 모낭 조직을 70%에탄올의 첫 번째 웰에 20초 동안 잠깐 위치시켜 치과에서 남은 혈액을 씻어낸 다음, 20초 동안 다음 사멸 에탄올 플레이트로 옮기고 더 나아가 세 번째 에탄올 웰로 옮긴다.
인산염 완충 식염수 웰에서 세 번 계속 헹구고 남은 세 개의 치과 모낭 수집 배지 웰에서 치과 모낭을 총 최대 20분 동안 헹구십시오. 헹굼 된 치과 모낭을 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 파라포름알데히드 고정을 위해 치과 모낭 중 하나의 작은 조각을 절단하고 최대 6 시간 동안 500 마이크로리터의 수집 배지가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 보관하십시오.
나머지 치과 모낭을 작은 조각으로 다듬어 네 밀리리터의 예열 해리 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음 튜브를 섭씨 37도에서 수조에서 두 시간 동안 배양하십시오. 매 15분마다, 치과용 모낭 해리 매질을 피펫하고 유리 피펫을 이용하여 위아래로 섞어 조직 붕해의 속도를 높인다. 치과 모낭 조각이 더 이상 관찰되지 않으면 좁아지고 불로 닦은 파스퇴르 피펫을 사용하여 해리를 진행하십시오.
그 동안 100 마이크로 리터의 DNase가 들어있는 10 밀리리터의 배지 A를 준비하고 해리 된 치과 모낭이있는 각 튜브에이 배지 5 밀리리터를 첨가하십시오. 실온에서 일분 동안 인큐베이션한다. 이 단계에서 한 명의 환자로부터 해리된 치과 모낭의 여러 튜브를 결합한 배지 1밀리리터로 필터를 헹구고 여과된 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 200배 g에서 원심분리합니다.
상층액을 제거하십시오. 펠렛을 무혈청 정의 배지 1밀리리터에 재현탁시키고 세포 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 세포 농도를 계산하고 시드할 수 있는 웰의 수를 계산합니다.
최종 혼합은 30 내지 70의 비율로 세포 현탁액 및 기저막 매트릭스로 구성된다. 적당량의 상층액을 제거하고 천천히 재현탁하여 도금을 위한 세포 현탁액에 대한 빙냉 기저막 매트릭스의 70 대 30 비율을 얻었다. 일단 기저막 매트릭스에 재현탁되면, 기저막 매트릭스 응고를 피하기 위해 마이크로원심분리 튜브를 얼음 위에 보관한다.
20 마이크로리터의 기저막 매트릭스 액적을 예열된 48-웰 배양 플레이트의 중앙에 피펫한다. 플레이트를 거꾸로 뒤집어 섭씨 37도의 1.9 % 이산화탄소 인큐베이터에서 20 분 동안 응고시킵니다. 로-연관 키나제 억제제와 암포테리신 B를 치아 오가노이드 배지에 첨가하고, 섭씨 37도 수조에서 배지를 예열한다.
인큐베이터에서 48웰 플레이트를 가져옵니다. 그것을 똑바로 세우고 준비된 미리 차열 된 배지 250 마이크로 리터를 세포가 들어있는 기저막 매트릭스 액적으로 각 웰에 첨가하고 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터로 되돌립니다. 매체를 새로 고치려면 플레이트를 45도 각도로 기울입니다.
기저막 매트릭스 액적을 만지지 않고 이전 배지를 부드럽게 제거하고 2 ~ 3 일마다 250 마이크로 리터의 새로운 예열 치아 오가노이드 배지를 첨가하십시오. 오가노이드의 통과를 수행하려면 오가노이드가있는 우물에서 배지를 제거하고 최대 네 개의 합류 우물을 풀링하십시오. 오가노이드를 수집하려면 웰 당 400 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지를 막 매트릭스 액적에 직접 넣고 전체 액적이 빠질 때까지 배지를 위아래로 반복적으로 피펫팅합니다.
우물이 풀링되면 400 마이크로 리터를 첫 번째 우물에서 다음 웰로 옮겨 물방울이 들어있는 오가노이드를 제거합니다. 탈락된 오가노이드 어셈블리를 1.5 마이크로리터 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 모든 오가노이드 구조가 웰로부터 수집될 때까지 무혈청 정의 배지의 첨가를 반복한다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다.
원심분리 튜브로부터 상층액을 제거하고 펠렛을 TrypLE Express의 예열 분취량에 재현탁시킨다. 400 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지를 첨가하여 효소를 불활성화시키고 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.
팁을 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의된 배지로 미리 코팅하고 오가노이드 펠릿을 멸균 상태로 재현탁한다. 펠렛을 저역 통과 방법에 대해 200 마이크로리터의 빙냉 무혈청 정의 배지에 재현탁시킨다. 완전히 비워진 피펫 팁을 마이크로 원심분리 튜브의 바닥에 밀어 직경을 줄입니다.
오가노이드를 기계적으로 파괴하기 위해 다섯 분 동안 피펫을 위아래로 피펫하십시오. 더 높은 통과 방법의 경우, 펠릿을 P1000 팁이있는 700 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 혈청이없는 정의 배지에 재현탁하십시오. 이 P1000 팁에 P200 팁을 추가하고 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지로 프리코트를 합니다.
피펫의 볼륨 설정을 조정하여 기포 형성을 방지합니다. 중간 부피의 90 % 이상을 오가노이드와 피펫으로 5 분 동안 위아래로 열망하여 오가노이드를 기계적으로 파괴하십시오. 오가노이드는 일반적으로 치과 모낭 세포 파종 후 두 주 후에 발생합니다.
오가노이드는 최대 11 개의 통로까지 장기간 확장 가능합니다. 기저막 매트릭스 액적 당 약 20, 000 개의 세포를 시딩하면 최적의 오가노이드 밀도가 생성되는 반면, 더 높은 세포 수를 시드하면 성장할 공간이 부족하여 너무 높은 밀도에서 유사한 오가노이드를 가진 차선책의 오가노이드 성장이 발생합니다. 개발 된 오가노이드는 조밀 한 외관을 보여 주며 높은 핵세포질 비율을 나타내는 세포를 포함합니다.
더욱이, 오가노이드는 그들의 상피 기원을 확인하는 ERM 마커 시토케라틴 14 및 다른 제안된 ERM 마커, 예컨대 P63, CD44, 및 인테그린 알파-6을 발현한다. 오가노이드는 마우스에서 잘 알려진 DESC 마커인 SOX2를 발현한다. 흥미롭게도, 에나멜 매트릭스의 주요 구성 요소 인 아멜로게닌도 오가노이드로 표현됩니다.
오가노이드는 마커의 안정한 발현에 의해 나타난 바와 같이 패시징 동안 그들의 ERMM 줄기 표현형을 유지한다. 최적의 장기 오가노이드 성장을 위해, 권장되는 통과 방법 의미 또는 낮은 통과 방법 또는 더 높은 통과 방법을 사용하는 것이 필수적이다. 일단 형성되면, 오가노이드는 아멜로제닉 과정을 추가로 면밀히 조사하고 현재 치과 연구에서 달성되지 않은 에나멜 매트릭스 침착을 사용하여 사용할 수 있습니다.
이 기술은 치과 상피 줄기 세포 생물학, 에나멜 형성 과정 및 올바른 치아 형성에 필수적인 상호 작용 인 치아 중간엽과의 상호 작용을 탐구 할 수있게합니다.
