이 프로토콜은 핵과 세포질에서 정의된 생화학적 요소의 다양한 역할을 평가하고 다양한 세포주 내에서 이러한 도메인 간의 세포 내 상호 작용을 분석하는 데 필요합니다. 이 기술은 일반적인 실험실 장비와 시약을 사용하여 세포질 및 핵 분획을 보다 효율적으로 분리합니다. 이 프로토콜은 다른 프로토콜보다 저렴하고 빠르게 수행할 수 있습니다.
세포질 및 핵 상호 작용에 대한 연구가 더 널리 퍼짐에 따라 세포 내 사건에 대한 국소화의 영향이 더 잘 이해될 수 있습니다. 세포질과 핵 사이의 교환을 분석 할 수 있으며, 핵 단백질에 대한 연구에서 알 수 있듯이 이러한 교환 중 특정 분자가 암 발병으로 이어질 수 있는지 여부를 나타냅니다. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 용해 완충액의 농도를 적절한 농도로 수정하는 것입니다.
용해 완충액의 사용은 주로 세포막의 파괴에 따라 달라지며 다양한 세포주에서 용해 완충액의 효과에 자연적인 변이가 있습니다. 시작하려면 2000G에서 5분 동안 원심분리를 통해 1.5밀리리터 튜브를 사용하여 세포를 펠릿으로 만듭니다. 펠릿을 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 용해 완충액에 재현탁합니다.
그런 다음 튜브를 섭씨 4도에서 약 12, 000G의 속도로 2 분 동안 돌립니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 새 1.5 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 나머지 펠릿은 핵 분획이 될 것입니다.
다음에, 500 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 펠릿에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 2000 G에서 원심분리한다. qPCR을 사용하여 구획의 분리를 확인하려면 먼저 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 RNA를 보완 DNA로 전환합니다. 역전사효소 마스터 믹스를 준비합니다.
템플릿 RNA를 추가합니다. thermocycler에서 반응을 배양합니다. 정량적 중합효소 연쇄 반응 및 분석을 수행합니다.
cDNA 합성을 DEPC 물로 희석하여 최종 농도가 밀리리터당 20나노그램이 되도록 합니다. PCR 마스터 믹스를 사용하여 수동 지침을 사용하여 각 샘플에 대한 반응을 준비합니다. 세포질 및 핵 분획을 검출하는 데 필요한 상용 프로브를 확보합니다.
MALAT1을 핵 마커로, TUG1을 세포질 마커로 사용합니다. 개별 표본에 대한 각 기술 반복실험에 대해 각 성분에 3을 곱하여 각 성분의 부피를 계산합니다. 각 핵 및 세포질 샘플에 대해 혼합 핵 분획과 MALAT1, 세포질 분획과 MALAT1, 핵 분획과 TUG1 및 세포질 분획을 획득합니다.
용액을 혼합하기 위해 간략하게 와동하고 혼합물 20 마이크로리터를 광학 반응 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. qPCR에 사용되는 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮고 플레이트를 잠시 원심분리하여 기포를 제거한 다음 실온에서 5분 동안 300배 G에서 샘플을 회전시킵니다. 설계 및 해석 소프트웨어를 사용하여 사이클링 매개변수에 대한 표준 곡선을 선택합니다.
qPCR 소프트웨어를 사용하여 설정 실행을 선택합니다. 데이터 파일 속성 페이지에서 메서드 및 입력 주기 매개 변수를 선택합니다. 사이클 파라미터를 입력한 후 플레이트 탭을 선택하고 실행할 샘플을 입력합니다.
실행 시작을 선택합니다. 실행이 완료되면 샘플 이름, 목표 이름 및 정량화 주기가 포함된 데이터 스프레드시트를 만듭니다. MALAT1 샘플로 시작하여 핵 분율을 계산합니다.
MALAT1 핵 분획에서 MALAT1 세포질 분획을 뺍니다. MALAT1 샘플을 계속 사용하여 세포질 분획을 계산합니다. MALAT1 세포질 분획에서 MALAT1 핵 분획을 뺀 다음 음성 델타 CQ로 올린 두 가지를 계산합니다. TUG1 표본을 사용하여 계산을 수행합니다.
TUG1이 세포질 요소에 대한 양성 대조군으로 존재하는 경우, 세포질 분획 수준은 핵 분획 수준보다 높을 것으로 예상됩니다. MALAT1이 있는 샘플에서 세포질 분획 수준이 관찰되는 음성 결과. 이는 핵 분획에서 분리된 RNA의 오염을 나타내며, 잠재적으로 용해 농도가 너무 낮거나 너무 높기 때문입니다.
MALAT1 및 TUG1은 웨스턴 블랏 및 RNA 전기영동을 통해 확인된 바와 같이 핵 및 세포질 분리와 가장 높은 상관관계를 나타내어 시료의 순도 및 품질을 확인하였다. 또한, 핵 및 세포질 추출물의 순도는 라민을 핵 분획의 마커로 사용하고 알파-튜불린을 세포질 분획의 양성 마커로 사용하는 웨스턴 블롯으로 입증할 수 있습니다. 세포질 RNA 전기영동에서 피크가 관찰되지 않았으며, 이는 세포질 RNA 샘플에서 고품질이며 오염이 거의 또는 전혀 없음을 보여줍니다.
용해 완충액의 사용은 적절한 분획을 위해 매우 중요하며 용해 완충액 농도를 원하는 관심 세포주에 최적화하는 것이 필수적입니다. 이 기술은 다양한 연구 주제에 광범위하게 적용할 수 있는 핵 및 세포질 상호 작용에 대한 표적 연구를 가능하게 하고 특정 생물학적 요소의 국소화가 기능과 어떻게 상관관계가 있는지 더 잘 이해할 수 있도록 합니다.
