이 방법은 모델 구성을 허용하고 NAFLD에 대한 platycodin D의 보호 효과를 조사할 수 있는 AML-12 세포의 사용을 보여줍니다. 동물 모델의 사용에 대한 과도한 의존은 치료 약물 개발의 부담을 증가시킵니다. NAFLD 약물 개발의 초기 단계에서 세포 모델을 사용하는 것이 더 실용적이고 비용 효율적입니다.
이 TCM 모델은 platycodin D의 생물학적 기능에 대한 이해를 높이고 NAFLD 치료를 위한 다른 TCM의 사용을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 12웰 플레이트에 웰당 1밀리리터의 AML-12 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 12웰 플레이트를 4개의 다른 처리 그룹으로 나누고 대조군, PD 처리, PA 처리 및 PA 플러스 PD 처리 그룹으로 표시합니다.
웰 당 정상 세포 배양 배지 1 밀리리터를 대조군 및 PD 처리군에 첨가한다. 300 마이크로몰 팔미트산이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 PA 처리 및 PA 플러스 PD 처리 그룹에 추가합니다. 24시간 배양 후, 세포의 배양액을 제거한 다음, 1밀리리터의 무혈청 배지로 세포를 2회 세척하였다.
다음으로, 비히클이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 대조군에 추가하고, 1마이크로몰 플라티코딘 D가 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 PD 처리군에 추가합니다. PA 처리군에 300 마이크로몰 팔미트산이 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 추가하고, PA 플러스 PD 처리군에 300 마이크로몰 팔미트산과 1 마이크로몰 플라티코딘 D가 보충된 정상 세포 배양 배지 1밀리리터를 추가합니다. 세포를 24시간 동안 처리한 후, 웰 당 1 밀리리터의 1X PBS로 세포를 3회 세척한다.
그런 다음 웰 당 10 마이크로 몰 DCFH-DA의 100 마이크로 리터로 세포를 염색합니다. 세포를 어둠 속에서 30분 동안 배양한다. 인큐베이션 후, 세포를 1X PBS로 3회 세척하고, 1X PBS 1밀리리터를 각 웰에 첨가한다.
12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20X 대물렌즈를 사용하여 200X 배율에서 세포의 형태를 관찰합니다. 미토콘드리아 막 전위를 측정하기 위해, 이전에 준비된 처리된 세포를 웰 당 1 밀리리터의 1X PBS로 3회 세척한다. 그런 다음 밀리리터 JC-1 작업 용액 당 5 마이크로 그램의 100 마이크로 리터로 세포를 염색하고 어둠 속에서 섭씨 37도에서 30 분 동안 세포를 배양합니다.
그런 다음 세포를 1X PBS로 세 번 세척하고 각 웰에 1 밀리리터의 1X PBS를 첨가합니다. 12웰 플레이트를 현미경 스테이지에 놓고 20X 대물렌즈를 사용하여 200X 배율에서 세포의 형태를 관찰합니다. 처리된 세포를 용해하고 세포 용해물을 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브에 수집합니다.
튜브를 섭씨 4도에서 20분 동안 12, 000G에서 원심분리합니다. 그런 다음 5X SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 1:4의 부피비로 세포 용해물 상청액에 추가합니다. 다음으로, 12 웰을 가진 준비된 12 % SDS-PAGE 젤을 전기 영동 탱크에 넣고 1X SDS up 샘플 버퍼를 초순수로 희석하여 권장 높이 한계까지 추가합니다.
SDS-PAGE 전기영동 후, 0.45 미크론 PVDF 멤브레인으로 단백질의 전기전사를 수행한다. 차단막을 차단 완충액에 희석된 1차 항체의 5밀리리터에서 배양한다. LC-III, p62 및 베타-액틴에 특이적인 항체를 사용하십시오.
섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 그 다음 PVDF 멤브레인을 블로킹 완충액에서 10, 000으로 희석한 토끼 항마우스 LGG HRP 2차 항체와 함께 배양한다. 2 시간 동안 빛으로부터 보호 된 실온에서 멤브레인을 배양합니다.
배양 후 PVDF 멤브레인을 플라스틱 랩에 놓습니다. 적절한 양의 ECL 작업 용액을 추가하고 2분 동안 배양합니다. 그런 다음 ECL 작업 용액을 제거하고 이미지 현상을 위해 이미징 시스템에 PVDF 멤브레인을 노출시킵니다.
DCFH-DA 염색은 platycodin D가 ALM-12 세포에서 세포 내 ROS 수준을 유의하게 감소시킬 수 있음을 보여주었으며, 이는 이 치료가 세포 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 나타냅니다. 또한, JC-1 단량체 또는 탈분극된 미토콘드리아를 나타내는 녹색 형광은 처리되지 않은 세포보다 팔미트산 처리된 세포에서 더 높았으며, JC-1 이량체 또는 편광 미토콘드리아를 나타내는 적색 형광은 처리되지 않은 세포보다 팔미트산 처리된 세포에서 더 낮았으며, 이는 팔미트산 유도 MMP 탈분극을 나타냅니다. 또한, 모델군과 비교하여, JC-1 단량체 대 이량체의 비율은 플라티코딘 D 처리군에서 감소하여, 팔미트산 유도 MMP를 개선할 수 있음을 나타낸다.
자가포식 관련 단백질 LC-III 및 p62의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블랏팅으로 조사하였다. LC-32 대 LC-31의 비율은 유의하게 감소하였고 p62의 단백질 발현 수준은 팔미트산으로 처리된 후 증가하였다. 한편, platycodin D는 p62의 단백질 발현 수준을 유의하게 감소시키고 LC-32 대 LC-31의 비율을 증가시켜 팔미트산에 의해 유도된 자가포식 플럭스의 회복을 나타냅니다.
음성 대조군에서 세포의 형광 값이 상대적으로 높으면 형광 프로브의 작동 농도를 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
