번데기 제거 후 Drosophila Pupal 다리 발달의 장기 라이브 이미징

유기체는 그 모양이 엄청나게 다양합니다. 우리는 이러한 모양의 형성, 다양화 및 진화의 기저에 있는 분자 및 셀룰라 메커니즘에 매우 관심이 있습니다. 이를 이해하기 위해 우리는 세포가 초파리에서 성인 다리의 최종 모양을 형성하는 운명에 의해 어떻게 결정되는지 조사해 왔습니다.

라이브 이미징을 사용하여 우리는 세포의 예기치 않은 놀라운 행동을 발견했습니다. 다리의 최종 모양이 형성되는 동안, 상피 세포는 파르테논 신전과 같은 구조라고 명명한 것처럼 일시적으로 특수 구조를 형성했습니다. 이 구조는 상피 세포가 최종 모양을 형성하는 일반적인 특징인 것 같습니다 번데기 단계에서 장기간 라이브 이미징을 위해서는 수분을 유지하면서 번데기를 제거하는 것이 중요합니다.

유리 바닥 접시와 물 한 방울을 사용하는 우리의 방법은 안정적이고 신뢰할 수 있으며 초보자도 다루기 쉽습니다. 우리의 결과는 세포가 최종 형태 형성 과정에서 예상치 못한 동적 형태 변화를 겪는다는 것을 보여줍니다. 최종 형상 형성 메커니즘을 정확하게 이해하기 위해서는 세포 형태의 지속적인 변화를 철저히 파악하고 이러한 변화의 기전과 형태 형성에 대한 중요성을 조사하는 것이 필수적입니다.

다음으로 다루고자 하는 질문은 파르테논 신전과 같은 구조가 어떻게 일시적으로 형성되는지, 그리고 그것이 더 미세한 형태 형성에 어떻게 기여하는지입니다. 시작하려면 바이알에서 원하는 Drosophila melanogaster 균주의 흰색 번데기를 모아 붓을 사용하여 접시나 빈 바이알에 넣습니다. 수집된 흰 번데기를 원하는 관찰 단계에 도달할 때까지 섭씨 25도에서 최소 14시간 동안 부화시킵니다.

증류수에 적신 붓을 사용하여 번데기 표면에서 접착제와 파리 음식을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 청소한 번데기를 청소용 물티슈에 놓고 몇 분 동안 건조시킵니다. 이제 양면 테이프 조각을 유리 슬라이드에 부착하고 건조된 번데기를 복부 쪽이 아래를 향하도록 양면 테이프에 놓습니다.

마른 페인트 브러시를 사용하여 번데기의 등쪽을 부드럽게 밀어 양면 테이프에 대한 접착력을 향상시킵니다. 실체 현미경 아래에서 한 쌍의 집게를 사용하여 번데기의 수술부를 조심스럽게 엽니다. 열린 수술 가장자리에서 번데기와 번데기 사이의 공간에 집게의 한 끝을 삽입합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 번데기를 잡고 부서질 때까지 바깥쪽으로 당깁니다. 번데기의 찢어진 조각을 들어 올려 양면 테이프에 부착합니다. 시작하려면 이미징을 위해 Drosophila melanogaster 번데기 다리를 준비합니다.

사용하는 렌즈에 따라 1마이크로리터의 증류수 또는 실리콘 오일을 유리 바닥 접시 바닥에 바릅니다. 그런 다음 붓을 증류수에 담그고 번데기를 부드럽게 퍼냅니다. 번데기를 복부 쪽이 아래를 향하도록 접시에 담긴 증류수나 실리콘 오일 위에 놓습니다.

마이크로피펫을 사용하여 접시의 유리 부분 가장자리 근처에 증류수 10마이크로리터를 추가합니다. 주사기를 사용하여 접시의 유리 부분 가장자리 주위에 실리콘 그리스를 원형으로 바릅니다. 그런 다음 실리콘 그리스에 커버 슬립을 올려 접시를 밀봉합니다.

컨포칼 현미경과 소프트웨어를 켠 후 번데기가 있는 유리 바닥 접시를 현미경 스테이지에 놓고 원하는 관심 영역을 이미지화합니다. 족골의 상피 세포는 아피코기저 돌기와 기저 연결을 형성했는데, 이는 번데기 형성 후 16시간에서 27.5시간 사이에 파르테논 신전을 연상시킵니다. 번데기 형성 후 41시간에서 60시간까지 상피 두께의 점진적인 감소가 관찰되었으며, 이는 다리 조직 윤곽이 더 명확해진 후에도 관찰되었습니다.