이 기술은 조직에서 PrP 스크래피 기술에 의해 프리온 질병의 확증 진단을 가능하게 하고, PrP 스크래피 유형 및 분포를 분석하여 알려진 PrP 스크래피 침착 프로파일에 대한 징벌적 편차를 평가할 수 있습니다. 이 기술은 표준화되어 있으며 PrP 스크래피에 대한 특정 항체를 사용하여 조직에서 PrP 스크래피 증착을 시각화할 수 있습니다. 이 기술은 또한 신경 해부학 적 영역과 세포 유형에 대한 정보를 제공합니다.
조직 섹션이 있는 슬라이드를 스테인리스 스틸 염색 바구니에 넣는 것으로 시작합니다. 크실렌 욕조에서 바구니를 꺼냅니다. 3 분 후 바구니를 꺼내 다시 한 번 담그십시오.
자일렌을 제거하고 섹션을 재수화하려면 바구니를 절대 에탄올 욕조에 담그십시오. 3 분 후 바구니를 꺼내 다시 한 번 담그십시오. 섹션을 90% 에탄올 욕조에 1분 동안 넣기 전에 자연 건조시킵니다.
다음으로, 섹션을 70 % 에탄올 욕조로 1 분 더 옮깁니다. 각 에탄올 수조 처리에 대해 슬라이드 바스켓을 부드럽게 두 번 저어주고 다음 이송 전에 바스켓을 비우십시오. 바구니를 50% 에탄올 수조에 1분 동안 옮깁니다.
조직 절편을 실온에서 30분 동안 98% 포름산에 조심스럽게 담그십시오. 섹션을 수돗물로 5분 동안 헹구고 증류수로 두 번 헹굽니다. 500 밀리리터의 증류수로 채워진 압력 챔버에서 스테인레스 스틸 염색 용기를 사용하여 섭씨 98도에서 20 분 동안 10 밀리몰 구연산염 완충액을 전처리한다.
품질 관리를 위해 접착제 오토클레이브 표시기 테이프 부분을 바스켓에 올려 온도와 압력을 모니터링합니다. 알람이 장비가 프로그램 시간과 온도에 도달했음을 나타내면 슬라이드로 바구니를 담그십시오. 그런 다음 압력 챔버에서 설정 포인트 2까지 프로그램을 시작하고 이 프로그램의 초기 및 최종 압력을 기록합니다.
내인성 과산화효소의 비활성화를 위해 샘플 섹션이 들어 있는 슬라이드 바스켓을 메탄올의 3% 과산화수소 수조에 30분 동안 담그십시오. 흐르는 물에 5분 동안 다리를 놓으십시오. 배수 후 절편을 트리스 완충 식염수에 추가로 5분 동안 담그십시오. 면역 검출을 위해 조직 측면이 홀더를 향하고 슬라이드 가장자리가 홀더의 두 하단 지점과 일치하도록 트리스 완충 식염수로 미리 적신 시중에서 판매되는 커버 플레이트 홀더에 각 슬라이드를 놓습니다.
기포를 피하십시오. 엄지와 집게손가락 사이에 슬라이드 홀더 어셈블리를 잡습니다. 한 손가락을 샘플 슬라이드 위에 놓고 다른 손가락을 홀더 하단에 놓은 다음 어셈블리를 시스템 갤러리에 놓습니다.
세트가 잘 조립되었는지 확인하려면 샘플 슬라이드와 홀더 사이의 웰을 트리스 완충 식염수로 넘치지 않게 채웁니다. 이 시점부터 홀더와 슬라이드 사이에 약 80마이크로리터의 트리스 완충 식염수가 유지되어야 합니다. 섹션이 건조되지 않도록 하십시오.
1차 항체로 처리하기 전에 슬라이드 샘플을 트리스 완충 식염수에서 2차 항체 숙주와 동일한 종의 20% 정상 혈청으로 30분 동안 사전 배양하여 배경 염색을 감소시킵니다. 절편을 세척하지 않고, 200 마이크로리터의 1차 항체 용액을 슬라이드-홀더 세트의 각 웰에 직접 적용하고, 실온에서 60분 동안 인큐베이션한다. 섹션을 씻으려면 트리스 완충 식염수로 우물을 채우고 5 분 동안 기다리십시오.
세탁을 두 번 반복하십시오. 다음으로, 비오티닐화된 2차 항체를 10% 말 혈청으로 트리스 완충 식염수에 1-200 농도로 희석합니다. 치료할 섹션의 수에 따라 필요한 볼륨을 수리하십시오.
200 마이크로리터의 2차 항체 용액을 슬라이드 홀더 세트의 각 웰에 적용한다. 실온에서 30분 동안 배양한 후 트리스 완충 식염수 세척을 반복합니다. 아비딘-비오틴 복합체 과산화효소로 배양하기 위해 사용 30분 전에 시약을 준비하고 슬라이드 플레이트 홀더의 각 웰에 200마이크로리터의 용액을 도포합니다.
완료되면 플레이트 홀더 세트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 알려진 전염성 해면상 뇌병증-음성 대조군 동물에서 비특이적 면역표지의 수준은 특이적 비정상 프리온 단백질 면역표지를 적절하게 해석하기 위해 결정되었습니다. 항-PrP 항체에 의한 비표적 표지는 개별적인 뉴런 내 미세 미립자 염색, 뉴로필의 불규칙한 미세 선형 염색, 일부 회백질 영역에서의 확산 비미립자 라벨링, 뉴런의 확산 세포질 라벨링으로 발생하는 것으로 나타났습니다.
이 표는 양성 진단을 위한 소 해면상 뇌병증, 고전적 및 비정형 스크래피, 자궁경부의 만성 소모성 질환에서 관찰되는 면역 표지된 비정상 프리온 단백질 유형에 대한 설명과 음성, 결정적이지 않고 부적절한 결과에 대한 확립된 기준을 요약합니다. 모든 단계는 매우 중요합니다. 용액의 pH와 실온은 이 기술의 성공을 위한 중요한 특징입니다.
PrP 스크래피와 세포 유형을 모두 검출하기 위한 면역조직화학을 개발하면 주요 발병기전에 관여하는 각 세포에 대한 정보를 얻을 수 있습니다.
